第一章 引言
1.1 乳酸菌與發酵食品
發酵食品是指利用微生物或酶加工後的食品，例如奶酪、發酵香腸、泡菜等。我國傳統發酵食品種類繁多，蘊含的微生物種類豐富，其中乳酸菌是其中最為重要的微生物類群。
乳酸菌是一類能利用可發酵糖類、能產生大量乳酸、無芽孢的革蘭氏陽性細菌的總稱，包括了 Lactococcus、Lactobacillus、Enterococcus、Leuconostoc、Streptococcus、Bifidobacterium 等多個屬的細菌。乳酸菌在發酵食品製作中扮演著極為重要的角色。首先，在發酵過程中，乳酸菌能迅速產生有機酸、乙醇等，並且很多乳酸菌能合成具有抗菌作用的細菌素，這對於抑制致病致腐菌具有重要意義。其次，乳酸菌能產生一系列重要的酶[2-4]，可促進食品原料的快速利用，而且乳酸菌能合成很多芳香物質，對於食品風味的形成發揮著關鍵作用。此外，乳酸菌還能產生其他多種功能性成分，如 γ-氨基丁酸、胞外多糖等，有效的提升了發酵食品的營養功能或改進了食品的質地[1]。長期以來，發酵食品中長期使用的乳酸菌被認為是安全的，但是近年研究發現，某些乳酸菌也具有耐藥性，而且有的還具有可轉移耐藥性，極可能引發食品安全問題。因此評價乳酸菌菌株安全性近年來成為國際研究熱點。中國的發酵食品種類居全球首位，尤其是中國的傳統發酵食品種類繁多，是食品工業和國民經濟中的重要組成部分。中國傳統發酵食品製造中大多採用自然接種，其次環境和原料中乳酸菌影響著發酵食品的安全性和功能性。在保障乳酸菌安全性的前提下，篩選高產功能物質的乳酸菌具有重要的應用前景。因此，下面分別對乳酸菌耐藥性、γ-氨基丁酸和胞外多糖的研究進展作一綜述。
1.2 乳酸菌與耐藥性
1.2.1 抗生素與微生物的耐藥機制
抗生素是一類由微生物產生的具有抑菌或殺菌功能的次級代謝產物。雖然，抗生素的應用為人類治療疾病做出了重大貢獻，但是由於抗生素的過度使用和誤用，對環境微生物造成了抗生素選擇壓力，使得各種耐藥性微生物不斷湧現，為疾病的治療帶來了挑戰。微生物的耐藥性產生機制可大致分為四種：
（1）由於基因突變或產生相應的修飾酶導致抗生素作用靶點的改變；
（2）菌體結構改變，如細胞膜滲透性的改變導致藥物無法進入細胞；
（3）產生修飾或降解抗生素的酶，使抗生素失效；
（4）通過藥物泵將抗生素轉移到胞外[5-7]。細菌耐藥性大致可分為固有性耐藥和獲得性耐藥兩類。固有性耐藥一般不會發生轉移，如大部分乳酸菌對抗革蘭陰性菌的抗生素具有固有耐藥性[8]。
獲得性耐藥大多數是由於抗生素的選擇性壓力引起的，耐藥基因既可由自身基因突變產生，也可從外界獲得，後者具有在細菌間水平轉移的可能性。耐藥性的轉移可通過接合、轉化及轉導三種方式進行[9]。因許多可轉移的耐藥性基因位於質粒或轉座子這類活躍的可移動元件上，且接合作用能使 DNA 跨種界轉移，使得接合成為了耐藥性水平傳遞的主要方式。
第二章 實驗材料與方法
2.1 實驗材料
MRS 培養基：1 %（w/v，下同）蛋白腖，0.5 %酵母提取物，1 %牛肉浸膏，2 %葡萄糖，0.3 %無水乙酸鈉，0.2 %檸檬酸三銨，0.2 %磷酸二氫鉀，0.01 %無水硫酸鎂，0.025%一水硫酸錳，0.1 %吐溫 80，pH 6.8。PYG 培養基：在 MRS 的基礎上添加 1%的谷氨酸鈉（sodium glutamate，MSG）。SDM 培養基[81]：1 %細菌蛋白腖，0.5 %酵母氮源，2 %乳糖，0.5 %無水乙酸鈉，0.2 %檸檬酸三銨，0.2 %磷酸二氫鉀，0.01 %七水硫酸鎂，0.05 %硫酸錳，0.1 %吐溫 80，pH 6.8。LSM 培養基：90 %為 Isosensitest（OXOID），10 %為 MRS，混合後使用。ALSM 培養基：在 LSM 的基礎上添加如下濃度的抗生素，四環素 0.25-512 mg/L，紅黴素 1-512 mg/L，卡那黴素 1-2048 mg/L，氯黴素 0.25-64 mg/L，環丙沙星 0.5-64 mg/L，克林黴素 0.5-128 mg/L，氨苄青黴素 0.25-64 mg/L。LBN 培養基：在 LSM 的基礎上加入 0.02%溴甲酚紫指示劑，50 mg/L 制黴菌素。ALBN 培養基：在 LBN 培養基的基礎上添加一定濃度的抗生素，抗生素的添加量依據 EFSA 標準中乳酸菌種屬的最高閥值（breakpoint）選取如下：氯黴素 8 mg/L，卡那黴素 512 mg/L，四環素 32 mg/L，環丙沙星 4 mg/L，氨苄青黴素鈉 4 mg/L，克林黴素4 mg/L，紅黴素 4 mg/L。LB 培養基：1%蛋白腖，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，pH 7.0。TSB 培養基：購自美國 BD 公司。BHI 培養基：購自 Biosharp 公司以上培養基製備成固體培養基時需添加 1.5%瓊脂粉。
2.1.2 菌株、載體、
引物菌 株 ： Escherichia coli JM109 、 Staphylococcus aureus ATCC25923 、 Listeriamonocytogenes NB、Lactobacillus casei LPC-37、Lactococcus Lactis MN256、Streptococcusthermophilus MN168，本實驗室保藏。質粒載體：pMD19-T Simple Vector，購自寶生物工程（大連）有限公司。引物：本文所有的引物信息詳見表 2-1.
第二章 實驗材料與方法 ...................................................17-28
2.1 實驗材料 ...................................................17-20
2.1.1 培養基................................................... 17
2.1.2 菌株、載體、引物................................................... 17-18
2.1.3 工具酶、試劑及試劑盒 ...................................................18-19
2.1.4 發酵食品及來源................................................... 19
2.1.5 主要儀器 ...................................................19-20
2.2 分子生物學及微生物學的基本操作................................................... 20-22
第三章 結果與討論 ...................................................28-43
3.1食品中乳酸菌耐藥性的初步研究................................................... 28-35
3.1.1發酵食品中耐藥乳酸菌的比例統計................................................... 28-29
3.1.2 耐藥乳酸菌呈現多重耐藥性 ...................................................29-31
3.2食品中產GABA 乳酸菌的篩選...................................................35-39
3.3食品中產EPS 乳酸菌的篩選...................................................39-43
第四章 結論與展望................................................... 43-45
4.1 結論................................................... 43
4.1.1 對11 種食品中含乳酸菌的耐藥性分析................................................... 43
4.1.2食品中高產GABA 乳酸菌的篩選...................................................43
4.1.3食品中高產EPS 乳酸菌的篩選...................................................43
4.2 展望................................................... 43-45
結論
首先，統計了 11 種發酵食品中的乳酸菌對 7 種抗生素的耐藥比例，發現各種食品中存在不同程度的耐藥乳酸菌，且耐藥菌的比例與食品原料來源、種類、加工環境及加工方法密切相關。其次，選取從各種發酵食品中分離得到的 14 株耐藥菌進一步深入研究，發現多數存在多重耐藥能力，且個別菌株對某些抗生素的抗性極強。然後，通過PCR 擴增已知的耐藥基因，發現有的菌在質粒和/或染色體上存在耐藥基因，而有的菌中不存在這些已知的耐藥基因。最後，通過電轉化實驗證實了分離自以上菌株的一些耐藥質粒具備跨種屬的水平轉移能力。
從 22 種中國傳統發酵食品中分離到 257 株乳酸菌，並用紙層析法從中篩選到產 γ-氨基丁酸的乳酸菌 5 株，其中 L. fermentium MT133 產 GABA 的能力最強。經過發酵條件的初步摸索，確定其最佳的條件為：底物 0.25 mol/L，CaCl25 mmol/L，靜置發酵 84 h時，最終發酵液中 GABA 濃度可達到 20.57 g/L。最後，對 GABA 合成途徑中的關鍵基因 gadB 進行了序列分析和克隆研究。
通過菌落觀察及菌落拉絲法從 257 株乳酸菌中篩選得到能高產 EPS 的乳酸菌。篩選獲得 4 株能高產 EPS 的乳酸菌，經 DNA 鑑定其中 1 株為 Leuconostoc mesenteroides、1株為 Lactobacillus plantarum、2 株為 Streptococcus thermophilus。進一步考察了溫度和碳源對這些乳酸菌生產 EPS 的影響，發現最適生長溫度有利於 EPS 的總量積累，而低溫條件（25 ℃）則有利於粘性 EPS 的形成；乳糖有利於 S. thermophilus 和 L. mesenteroides產 EPS，而蔗糖有利於 L. plantarum 產 EPS。乳酸菌 Ln. mesenteroides MT257 的 EPS 產量可達 335 mg/L。
1.1 乳酸菌與發酵食品
發酵食品是指利用微生物或酶加工後的食品，例如奶酪、發酵香腸、泡菜等。我國傳統發酵食品種類繁多，蘊含的微生物種類豐富，其中乳酸菌是其中最為重要的微生物類群。
乳酸菌是一類能利用可發酵糖類、能產生大量乳酸、無芽孢的革蘭氏陽性細菌的總稱，包括了 Lactococcus、Lactobacillus、Enterococcus、Leuconostoc、Streptococcus、Bifidobacterium 等多個屬的細菌。乳酸菌在發酵食品製作中扮演著極為重要的角色。首先，在發酵過程中，乳酸菌能迅速產生有機酸、乙醇等，並且很多乳酸菌能合成具有抗菌作用的細菌素，這對於抑制致病致腐菌具有重要意義。其次，乳酸菌能產生一系列重要的酶[2-4]，可促進食品原料的快速利用，而且乳酸菌能合成很多芳香物質，對於食品風味的形成發揮著關鍵作用。此外，乳酸菌還能產生其他多種功能性成分，如 γ-氨基丁酸、胞外多糖等，有效的提升了發酵食品的營養功能或改進了食品的質地[1]。長期以來，發酵食品中長期使用的乳酸菌被認為是安全的，但是近年研究發現，某些乳酸菌也具有耐藥性，而且有的還具有可轉移耐藥性，極可能引發食品安全問題。因此評價乳酸菌菌株安全性近年來成為國際研究熱點。中國的發酵食品種類居全球首位，尤其是中國的傳統發酵食品種類繁多，是食品工業和國民經濟中的重要組成部分。中國傳統發酵食品製造中大多採用自然接種，其次環境和原料中乳酸菌影響著發酵食品的安全性和功能性。在保障乳酸菌安全性的前提下，篩選高產功能物質的乳酸菌具有重要的應用前景。因此，下面分別對乳酸菌耐藥性、γ-氨基丁酸和胞外多糖的研究進展作一綜述。
1.2 乳酸菌與耐藥性
1.2.1 抗生素與微生物的耐藥機制
抗生素是一類由微生物產生的具有抑菌或殺菌功能的次級代謝產物。雖然，抗生素的應用為人類治療疾病做出了重大貢獻，但是由於抗生素的過度使用和誤用，對環境微生物造成了抗生素選擇壓力，使得各種耐藥性微生物不斷湧現，為疾病的治療帶來了挑戰。微生物的耐藥性產生機制可大致分為四種：
（1）由於基因突變或產生相應的修飾酶導致抗生素作用靶點的改變；
（2）菌體結構改變，如細胞膜滲透性的改變導致藥物無法進入細胞；
（3）產生修飾或降解抗生素的酶，使抗生素失效；
（4）通過藥物泵將抗生素轉移到胞外[5-7]。細菌耐藥性大致可分為固有性耐藥和獲得性耐藥兩類。固有性耐藥一般不會發生轉移，如大部分乳酸菌對抗革蘭陰性菌的抗生素具有固有耐藥性[8]。
獲得性耐藥大多數是由於抗生素的選擇性壓力引起的，耐藥基因既可由自身基因突變產生，也可從外界獲得，後者具有在細菌間水平轉移的可能性。耐藥性的轉移可通過接合、轉化及轉導三種方式進行[9]。因許多可轉移的耐藥性基因位於質粒或轉座子這類活躍的可移動元件上，且接合作用能使 DNA 跨種界轉移，使得接合成為了耐藥性水平傳遞的主要方式。
第二章 實驗材料與方法
2.1 實驗材料
MRS 培養基：1 %（w/v，下同）蛋白腖，0.5 %酵母提取物，1 %牛肉浸膏，2 %葡萄糖，0.3 %無水乙酸鈉，0.2 %檸檬酸三銨，0.2 %磷酸二氫鉀，0.01 %無水硫酸鎂，0.025%一水硫酸錳，0.1 %吐溫 80，pH 6.8。PYG 培養基：在 MRS 的基礎上添加 1%的谷氨酸鈉（sodium glutamate，MSG）。SDM 培養基[81]：1 %細菌蛋白腖，0.5 %酵母氮源，2 %乳糖，0.5 %無水乙酸鈉，0.2 %檸檬酸三銨，0.2 %磷酸二氫鉀，0.01 %七水硫酸鎂，0.05 %硫酸錳，0.1 %吐溫 80，pH 6.8。LSM 培養基：90 %為 Isosensitest（OXOID），10 %為 MRS，混合後使用。ALSM 培養基：在 LSM 的基礎上添加如下濃度的抗生素，四環素 0.25-512 mg/L，紅黴素 1-512 mg/L，卡那黴素 1-2048 mg/L，氯黴素 0.25-64 mg/L，環丙沙星 0.5-64 mg/L，克林黴素 0.5-128 mg/L，氨苄青黴素 0.25-64 mg/L。LBN 培養基：在 LSM 的基礎上加入 0.02%溴甲酚紫指示劑，50 mg/L 制黴菌素。ALBN 培養基：在 LBN 培養基的基礎上添加一定濃度的抗生素，抗生素的添加量依據 EFSA 標準中乳酸菌種屬的最高閥值（breakpoint）選取如下：氯黴素 8 mg/L，卡那黴素 512 mg/L，四環素 32 mg/L，環丙沙星 4 mg/L，氨苄青黴素鈉 4 mg/L，克林黴素4 mg/L，紅黴素 4 mg/L。LB 培養基：1%蛋白腖，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，pH 7.0。TSB 培養基：購自美國 BD 公司。BHI 培養基：購自 Biosharp 公司以上培養基製備成固體培養基時需添加 1.5%瓊脂粉。
2.1.2 菌株、載體、
引物菌 株 ： Escherichia coli JM109 、 Staphylococcus aureus ATCC25923 、 Listeriamonocytogenes NB、Lactobacillus casei LPC-37、Lactococcus Lactis MN256、Streptococcusthermophilus MN168，本實驗室保藏。質粒載體：pMD19-T Simple Vector，購自寶生物工程（大連）有限公司。引物：本文所有的引物信息詳見表 2-1.
第二章 實驗材料與方法 ...................................................17-28
2.1 實驗材料 ...................................................17-20
2.1.1 培養基................................................... 17
2.1.2 菌株、載體、引物................................................... 17-18
2.1.3 工具酶、試劑及試劑盒 ...................................................18-19
2.1.4 發酵食品及來源................................................... 19
2.1.5 主要儀器 ...................................................19-20
2.2 分子生物學及微生物學的基本操作................................................... 20-22
第三章 結果與討論 ...................................................28-43
3.1食品中乳酸菌耐藥性的初步研究................................................... 28-35
3.1.1發酵食品中耐藥乳酸菌的比例統計................................................... 28-29
3.1.2 耐藥乳酸菌呈現多重耐藥性 ...................................................29-31
3.2食品中產GABA 乳酸菌的篩選...................................................35-39
3.3食品中產EPS 乳酸菌的篩選...................................................39-43
第四章 結論與展望................................................... 43-45
4.1 結論................................................... 43
4.1.1 對11 種食品中含乳酸菌的耐藥性分析................................................... 43
4.1.2食品中高產GABA 乳酸菌的篩選...................................................43
4.1.3食品中高產EPS 乳酸菌的篩選...................................................43
4.2 展望................................................... 43-45
結論
首先，統計了 11 種發酵食品中的乳酸菌對 7 種抗生素的耐藥比例，發現各種食品中存在不同程度的耐藥乳酸菌，且耐藥菌的比例與食品原料來源、種類、加工環境及加工方法密切相關。其次，選取從各種發酵食品中分離得到的 14 株耐藥菌進一步深入研究，發現多數存在多重耐藥能力，且個別菌株對某些抗生素的抗性極強。然後，通過PCR 擴增已知的耐藥基因，發現有的菌在質粒和/或染色體上存在耐藥基因，而有的菌中不存在這些已知的耐藥基因。最後，通過電轉化實驗證實了分離自以上菌株的一些耐藥質粒具備跨種屬的水平轉移能力。
從 22 種中國傳統發酵食品中分離到 257 株乳酸菌，並用紙層析法從中篩選到產 γ-氨基丁酸的乳酸菌 5 株，其中 L. fermentium MT133 產 GABA 的能力最強。經過發酵條件的初步摸索，確定其最佳的條件為：底物 0.25 mol/L，CaCl25 mmol/L，靜置發酵 84 h時，最終發酵液中 GABA 濃度可達到 20.57 g/L。最後，對 GABA 合成途徑中的關鍵基因 gadB 進行了序列分析和克隆研究。
通過菌落觀察及菌落拉絲法從 257 株乳酸菌中篩選得到能高產 EPS 的乳酸菌。篩選獲得 4 株能高產 EPS 的乳酸菌，經 DNA 鑑定其中 1 株為 Leuconostoc mesenteroides、1株為 Lactobacillus plantarum、2 株為 Streptococcus thermophilus。進一步考察了溫度和碳源對這些乳酸菌生產 EPS 的影響，發現最適生長溫度有利於 EPS 的總量積累，而低溫條件（25 ℃）則有利於粘性 EPS 的形成；乳糖有利於 S. thermophilus 和 L. mesenteroides產 EPS，而蔗糖有利於 L. plantarum 產 EPS。乳酸菌 Ln. mesenteroides MT257 的 EPS 產量可達 335 mg/L。
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