王冬冬，陳雪紅，曹冬梅，李 萌，王昌濤
（北京工商大學理學院生物技術系/北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京 100048）
摘要：採用乙醇和微生物的方法對馬齒莧（Portulaca oleracea L．）和銀杏（Ginkgo biloba L．）葉進行黃酮的提取，並測定粗提液對DPPH自由基的清除作用。結果表明，乙醇提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2．00％和4．37％，微生物提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2．07％和4．84％。馬齒莧和銀杏葉微生物提取液對DPPH自由基的清除作用在相同的稀釋倍數下高於乙醇提取液，表明微生物提取植物中黃酮具有一定的可行性和優越性。
關鍵詞 ：馬齒莧（Portulaca oleracea L．）；銀杏（Ginkgo biloba L．）葉；黃酮；微生物；DPPH自由基
中圖分類號：TQ234．2；R284．2 文獻標識碼：A 文章編號：0439－8114（2015）06－1455－03
DOI：10．14088/j．cnki．issn0439－8114．2015．06．044
Microbiological Method of Extracting the Flavonoids from Purslane and Ginkgo Biloba and Analyses of Its Antioxidant Activity
WANG Dong－dong，CHEN Xue－hong，CAO Dong－mei，LI Meng，WANG Chang－tao
（School of sciences/Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，
Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）
Abstract： Ethanol method and microbiological method were used to extract flavonoids from purslane and Ginkgo biloba. DPPH radical scavenging effect of crude extraction was measured． The results showed that the rate of flavonids extracted from Ginkgo and purslane with ethanol method was 2．00％ and 4．37％. That from purslane and Ginkgo biloba with microbial method was 2．07％ and 4．84％． Scavenging of DPPH radicals of microbial extract at the same dilution factor was higher than that of ethanol extract， indicating that microbiologial method of extracting the flavonoids from plants had certain feasibility and superiority．
Key words： Portulaca oleracea L．；leaves of Ginkgo biloba L．；flavonoids； microorganism； DPPH
收稿日期：2014－09－29
基金項目：北京市教育委員會科技計劃面上項目（KM201310011007）；質檢公益性行業科研專項（20141009）
作者簡介：王冬冬（1989－），女，河北邢台人，在讀碩士研究生，研究方向為植物功效成分開發應用，（電話）13426015179（電子信箱）
jingyingwdd@sina．com；通信作者，王昌濤（1975－），男，教授，（電子信箱）wangct@th．btbu．edu．cn。
植物活性成分包括黃酮、多酚、生物鹼、皂苷等，廣泛存在於植物的葉、根、莖、果實中，是綜合利用的植物資源。植物活性成分具有抗氧化、抗菌、預防或抑制腫瘤等生理功能。植物活性成分因其高的安全性，已滲入到食品、醫藥、化妝品等行業［1，2］。因此，利用各種提取技術從植物中提取具有高活性的成分已經成為目前的研究熱點。傳統的提取技術包括有機溶劑提取法、熱水提取法、系統溶劑提取法等，但產品安全性低、耗時長、提取率低。安全性高、提取率高和環保的新型提取方法越來越受人們的關注。微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生長過程中分泌的多種酶，從而對植物中的活性成分進行提取和修飾［3－7］。
本研究以2種提取黃酮較為普遍的馬齒莧（Portulaca oleracea L．）和銀杏（Ginkgo biloba L．）葉為對象，以乙醇提取和微生物提取作為對比，檢測提取液中總黃酮的含量和提取液對DPPH自由基的清除作用，初步探究微生物法提取植物中黃酮的可行性與優越性。
1 材料與方法
1．1 材料與儀器
1．1．1 菌種 黃酒酵母，購自北京市食品釀造研究所。
1．1．2 供試材料 馬齒莧、銀杏葉，60 ℃烘乾至恆重，粉碎過50目篩備用。
1．1．3 試劑 蘆丁標準品（生化試劑，中國藥品生物製品檢定所）；DPPH（1，1－二苯基－2－三硝基苯肼）購自美國Sigma公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為市售國產分析純。
1．1．4 儀器 高壓滅菌鍋（上海申安醫療機械廠）、全溫度振蕩培養箱（太倉華美生化儀器廠）、水浴恆溫搖床（太倉華美生化儀器廠）、低速大容量台式離心機、紫外分光光度計UV－1240（日本島津）等。
1．2 黃酮的提取
1．2．1 乙醇提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧和銀杏葉粉末，按照1∶50料液比（g∶mL，下同）， 加入體積分數為60％的乙醇250 mL，於70 ℃水浴搖床中提取3 h，冷卻後4 000 r/min離心10 min，取上清液待測［8－12］。
1．2．2 微生物法提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧粉和銀杏葉粉，按照1∶50的料液比，加入去離子水250 mL，接入5％的黃酒酵母擴培菌液，於28 ℃、180 r/min的空氣搖床中提取48 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液待測。
1．3 黃酮含量的測定
1．3．1 標準曲線的繪製 準確配製1 mg/mL蘆丁標準液，精確吸取0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7 mL蘆丁標準液，補齊至1 mL，各加入0．3 mL 5％亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0．3 mL 10％硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，再加0．4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以空白試劑為對照，在510 nm下測吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標（x），以吸光度（y）為縱坐標繪製標準曲線。
1．3．2 黃酮提取率的測定 準確吸取1 mL的提取液，各加入0．3 mL 5％亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0．3 mL 10％硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1mol/L NaOH溶液，再加0．4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以提取溶劑作為空白對照，在510 nm下測其吸光度，由標準曲線計算出提取液中黃酮的含量。
黃酮提取率＝提取液中黃酮含量×提取液總體積/原料質量×100％
1．4 粗提液對DPPH自由基的清除作用
將提取液用提取溶劑稀釋梯度作為待測液，取等體積的待測液與2×10－4mol/L的DPPH溶液混勻為A1管；取等體積的無水乙醇與2×10－4 mol/L的DPPH溶液混勻為A2管；取等體積的無水乙醇與待測液混勻為A3管。反應30 min後，在517 nm下測A1、A2、A3管吸光度［13－15］。清除率計算公式為：
清除率＝［（A2＋A3）－A1］/A2×100％。
2 結果與分析
2．1 蘆丁標準曲線
對蘆丁標準液的濃度和吸光度進行線性回歸處理，計算得回歸方程：y＝1．098 9x＋0．006 6，R2＝0．999 5（圖1）。
2．2 黃酮提取率
以體積分數為60％的乙醇溶液提取馬齒莧黃酮和銀杏葉黃酮，粗提液中黃酮的總質量分別為99．81 mg和218．38 mg，提取率分別為2．00％和4．37％，以黃酒酵母提取馬齒莧黃酮和銀杏葉黃酮，粗提液中黃酮的總質量分別為103．38 mg和241．98 mg，提取率分別為2．07％和4．84％（圖2和圖3），馬齒莧和銀杏葉的微生物提取黃酮的提取率在一定程度上均高於乙醇提取率。
2．3 粗提液對DPPH自由基的清除作用
馬齒莧和銀杏葉的乙醇提取液和微生物提取液對DPPH自由基的清除作用見圖4和圖5。從圖4和圖5中可以看出，相同的稀釋倍數馬齒莧和銀杏葉的微生物提取液對DPPH自由基的清除率均高於乙醇提取液，即微生物提取液的抗氧化性高於乙醇提取液的抗氧化性。
3 小結與討論
本研究採用乙醇提取和微生物提取的方式對馬齒莧和銀杏葉進行黃酮的提取，結果表明，微生物提取液中的黃酮含量高於乙醇的提取液，2種方法的提取液對DPPH自由基清除作用的測定結果表明，微生物提取液的清除作用要高於乙醇提取液，可初步表明微生物提取方式提取了更多的黃酮，提取液具有更高的抗氧化活性。微生物法不必使用有機試劑、溫度適中、對環境無污染，更環保，更有效。對馬齒莧和銀杏葉這2種植物的初步分析結果可為其他植物進行微生物提取黃酮或者其他活性成分提供參考和借鑑。
參考文獻：
［1］ 劉春秀．植物活性成分的提取技術研究進展［J］．安徽農業科學， 2011，39（3）：1273－1274．
［2］ 郭 娟，范曉丹，楊日福，等．植物活性成分提取新技術及最新研究進展［J］．現代化工，2011，31（8）：22－26．
［3］ 耿 欣．發酵技術在中藥研究中的應用［J］．中醫藥信息，2011， 28（4）：149－151．
［4］ 張天英，支春翔，張 浩，等．茶葉發酵過程中多酚變化規律及抗氧化性研究［J］．湖北農業科學，2011，50（15）：3144－3147．
［5］ 於艷輝，程智慧，張慶春，等．五種微生物發酵劑對玉米芯的發酵效果［J］．北方園藝，2010（14）：27－31．
［6］ 王興紅，李祺德，曹秋娥．微生物發酵中藥應成為中藥研究的新內容［J］．中草藥，2001，32（3）：267－269．
［7］ 蔡清宇，鄭虎占，王 敏．4種發酵法炮製中藥材的微生物初步研究［J］．中國實驗方劑學雜誌，2012，18（6）：119－122．
［8］ 伊長文，楚凱賓．馬齒莧黃酮提取工藝研究［J］．食品研究與開發， 2008，29（2）：79－82．
［9］ 王桂華．馬齒莧總黃酮的提取工藝研究［J］．江西中醫學院學報， 2011，23（6）：43－45．
［10］ 徐守霞．銀杏葉中黃酮類化合物的提取工藝研究［J］．安徽農業科學，2012，40（2）：706－707．
［11］ 田呈瑞，李 昀．銀杏葉黃酮的乙醇提取方法研究［J］．西北植物學報，2001，21（3）：556－561．
［12］ 劉德汞，緱 星，曹書勤，等．銀杏葉中總黃酮的提取［J］．信陽師範學院學報，2012，25（3）：352－355．
［13］ 苑子夜，蘇印泉，張 強，等．DPPH·法評價杜仲葉提取物的抗氧化活性［J］．西北林學院學報，2011，26（6）：119－123．
［14］ 鄭 紅，劉德勝，丁媛媛，等．茅莓黃酮體外抗氧化活性研究［J］． 湖北農業科學，2013，52（23）：5828－5831．
［15］ 許麗麗，蔡文軍．水葫蘆葉中總黃酮的提取及其抗氧化性研究［J］．湖北農業科學，2013，52（5）：1131－1134．
（北京工商大學理學院生物技術系/北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京 100048）
摘要：採用乙醇和微生物的方法對馬齒莧（Portulaca oleracea L．）和銀杏（Ginkgo biloba L．）葉進行黃酮的提取，並測定粗提液對DPPH自由基的清除作用。結果表明，乙醇提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2．00％和4．37％，微生物提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2．07％和4．84％。馬齒莧和銀杏葉微生物提取液對DPPH自由基的清除作用在相同的稀釋倍數下高於乙醇提取液，表明微生物提取植物中黃酮具有一定的可行性和優越性。
關鍵詞 ：馬齒莧（Portulaca oleracea L．）；銀杏（Ginkgo biloba L．）葉；黃酮；微生物；DPPH自由基
中圖分類號：TQ234．2；R284．2 文獻標識碼：A 文章編號：0439－8114（2015）06－1455－03
DOI：10．14088/j．cnki．issn0439－8114．2015．06．044
Microbiological Method of Extracting the Flavonoids from Purslane and Ginkgo Biloba and Analyses of Its Antioxidant Activity
WANG Dong－dong，CHEN Xue－hong，CAO Dong－mei，LI Meng，WANG Chang－tao
（School of sciences/Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，
Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）
Abstract： Ethanol method and microbiological method were used to extract flavonoids from purslane and Ginkgo biloba. DPPH radical scavenging effect of crude extraction was measured． The results showed that the rate of flavonids extracted from Ginkgo and purslane with ethanol method was 2．00％ and 4．37％. That from purslane and Ginkgo biloba with microbial method was 2．07％ and 4．84％． Scavenging of DPPH radicals of microbial extract at the same dilution factor was higher than that of ethanol extract， indicating that microbiologial method of extracting the flavonoids from plants had certain feasibility and superiority．
Key words： Portulaca oleracea L．；leaves of Ginkgo biloba L．；flavonoids； microorganism； DPPH
收稿日期：2014－09－29
基金項目：北京市教育委員會科技計劃面上項目（KM201310011007）；質檢公益性行業科研專項（20141009）
作者簡介：王冬冬（1989－），女，河北邢台人，在讀碩士研究生，研究方向為植物功效成分開發應用，（電話）13426015179（電子信箱）
jingyingwdd@sina．com；通信作者，王昌濤（1975－），男，教授，（電子信箱）wangct@th．btbu．edu．cn。
植物活性成分包括黃酮、多酚、生物鹼、皂苷等，廣泛存在於植物的葉、根、莖、果實中，是綜合利用的植物資源。植物活性成分具有抗氧化、抗菌、預防或抑制腫瘤等生理功能。植物活性成分因其高的安全性，已滲入到食品、醫藥、化妝品等行業［1，2］。因此，利用各種提取技術從植物中提取具有高活性的成分已經成為目前的研究熱點。傳統的提取技術包括有機溶劑提取法、熱水提取法、系統溶劑提取法等，但產品安全性低、耗時長、提取率低。安全性高、提取率高和環保的新型提取方法越來越受人們的關注。微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生長過程中分泌的多種酶，從而對植物中的活性成分進行提取和修飾［3－7］。
本研究以2種提取黃酮較為普遍的馬齒莧（Portulaca oleracea L．）和銀杏（Ginkgo biloba L．）葉為對象，以乙醇提取和微生物提取作為對比，檢測提取液中總黃酮的含量和提取液對DPPH自由基的清除作用，初步探究微生物法提取植物中黃酮的可行性與優越性。
1 材料與方法
1．1 材料與儀器
1．1．1 菌種 黃酒酵母，購自北京市食品釀造研究所。
1．1．2 供試材料 馬齒莧、銀杏葉，60 ℃烘乾至恆重，粉碎過50目篩備用。
1．1．3 試劑 蘆丁標準品（生化試劑，中國藥品生物製品檢定所）；DPPH（1，1－二苯基－2－三硝基苯肼）購自美國Sigma公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為市售國產分析純。
1．1．4 儀器 高壓滅菌鍋（上海申安醫療機械廠）、全溫度振蕩培養箱（太倉華美生化儀器廠）、水浴恆溫搖床（太倉華美生化儀器廠）、低速大容量台式離心機、紫外分光光度計UV－1240（日本島津）等。
1．2 黃酮的提取
1．2．1 乙醇提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧和銀杏葉粉末，按照1∶50料液比（g∶mL，下同）， 加入體積分數為60％的乙醇250 mL，於70 ℃水浴搖床中提取3 h，冷卻後4 000 r/min離心10 min，取上清液待測［8－12］。
1．2．2 微生物法提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧粉和銀杏葉粉，按照1∶50的料液比，加入去離子水250 mL，接入5％的黃酒酵母擴培菌液，於28 ℃、180 r/min的空氣搖床中提取48 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液待測。
1．3 黃酮含量的測定
1．3．1 標準曲線的繪製 準確配製1 mg/mL蘆丁標準液，精確吸取0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7 mL蘆丁標準液，補齊至1 mL，各加入0．3 mL 5％亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0．3 mL 10％硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，再加0．4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以空白試劑為對照，在510 nm下測吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標（x），以吸光度（y）為縱坐標繪製標準曲線。
1．3．2 黃酮提取率的測定 準確吸取1 mL的提取液，各加入0．3 mL 5％亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0．3 mL 10％硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1mol/L NaOH溶液，再加0．4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以提取溶劑作為空白對照，在510 nm下測其吸光度，由標準曲線計算出提取液中黃酮的含量。
黃酮提取率＝提取液中黃酮含量×提取液總體積/原料質量×100％
1．4 粗提液對DPPH自由基的清除作用
將提取液用提取溶劑稀釋梯度作為待測液，取等體積的待測液與2×10－4mol/L的DPPH溶液混勻為A1管；取等體積的無水乙醇與2×10－4 mol/L的DPPH溶液混勻為A2管；取等體積的無水乙醇與待測液混勻為A3管。反應30 min後，在517 nm下測A1、A2、A3管吸光度［13－15］。清除率計算公式為：
清除率＝［（A2＋A3）－A1］/A2×100％。
2 結果與分析
2．1 蘆丁標準曲線
對蘆丁標準液的濃度和吸光度進行線性回歸處理，計算得回歸方程：y＝1．098 9x＋0．006 6，R2＝0．999 5（圖1）。
2．2 黃酮提取率
以體積分數為60％的乙醇溶液提取馬齒莧黃酮和銀杏葉黃酮，粗提液中黃酮的總質量分別為99．81 mg和218．38 mg，提取率分別為2．00％和4．37％，以黃酒酵母提取馬齒莧黃酮和銀杏葉黃酮，粗提液中黃酮的總質量分別為103．38 mg和241．98 mg，提取率分別為2．07％和4．84％（圖2和圖3），馬齒莧和銀杏葉的微生物提取黃酮的提取率在一定程度上均高於乙醇提取率。
2．3 粗提液對DPPH自由基的清除作用
馬齒莧和銀杏葉的乙醇提取液和微生物提取液對DPPH自由基的清除作用見圖4和圖5。從圖4和圖5中可以看出，相同的稀釋倍數馬齒莧和銀杏葉的微生物提取液對DPPH自由基的清除率均高於乙醇提取液，即微生物提取液的抗氧化性高於乙醇提取液的抗氧化性。
3 小結與討論
本研究採用乙醇提取和微生物提取的方式對馬齒莧和銀杏葉進行黃酮的提取，結果表明，微生物提取液中的黃酮含量高於乙醇的提取液，2種方法的提取液對DPPH自由基清除作用的測定結果表明，微生物提取液的清除作用要高於乙醇提取液，可初步表明微生物提取方式提取了更多的黃酮，提取液具有更高的抗氧化活性。微生物法不必使用有機試劑、溫度適中、對環境無污染，更環保，更有效。對馬齒莧和銀杏葉這2種植物的初步分析結果可為其他植物進行微生物提取黃酮或者其他活性成分提供參考和借鑑。
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［9］ 王桂華．馬齒莧總黃酮的提取工藝研究［J］．江西中醫學院學報， 2011，23（6）：43－45．
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［14］ 鄭 紅，劉德勝，丁媛媛，等．茅莓黃酮體外抗氧化活性研究［J］． 湖北農業科學，2013，52（23）：5828－5831．
［15］ 許麗麗，蔡文軍．水葫蘆葉中總黃酮的提取及其抗氧化性研究［J］．湖北農業科學，2013，52（5）：1131－1134．
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