游 泳1 杜瑩瑩1 曹 媛1 李真珍2 張勝軍2
1.鄭州大學第一附屬醫院婦產科，河南鄭州 450052;2.河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南鄭州 450052
[摘要] 目的 觀察基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9及其抑制因子1(TIMP-1)和TIMP-2在宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)中的表達情況，分析其臨床意義。方法 選取CIN患者78例，分為CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ三組。採用RT-PCR檢測組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的陽性表達率和表達水平。同時，選取正常宮頸組織標本30例為對照組。比較各組相關因子表達差異。結果 CINⅢ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組，TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平分別顯著低於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅠ組和對照組，CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的表達水平顯著低於CINⅠ組和對照組(P<0.05)。結論 MMP-2、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2表達變化可能在CIN的發生、進展中起著重要作用。
[
關鍵詞 ] 基質金屬蛋白酶；基質金屬蛋白酶組織抑制物；宮頸上皮內瘤樣病變
[中圖分類號] R737.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2014）06（c）-0132-03
宮頸上皮內瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)是指宮頸不典型增生和宮頸原位癌，其為宮頸浸潤癌的癌前期病變。CIN進展演變為宮頸癌是一個連續的過程，明確CIN進展的分子機制對宮頸癌的預防和治療具有重要的意義。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一種可降解ECM的蛋白水解酶，與乳腺癌、胃癌、直腸癌等多種腫瘤的浸潤轉移密切相關；基質金屬蛋白酶組織抑制物(tissu inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMPs)是MMPs的天然抑制劑，與MMPs結合抑制其活性[1]。目前，已有文獻報道MMPs和TIMPs與宮頸癌的發生、發展有關[2]，但其在CIN各級中的表達情況尚不完全清楚。本研究分析了MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-1、TIMP-2在CIN中的表達情況及其臨床意義，報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2010年2月—2013年12月我院診治的宮頸上皮內瘤樣病變患者78例。年齡26～41歲，平均(34±2.9)歲。其中，CINⅠ級患者19例(CINⅠ組)、CINⅡ級患者28例(CINⅡ組)和CINⅢ級患者31例(CINⅢ組)。所有患者術前均未接受過放療、化療、免疫、冷凍和雷射等治療，經病理學確診。同時，取同期行手術治療的正常宮頸組織標本30例為對照組，年齡28～45歲，平均(36.5±3.8)歲。各組患者在年齡方面無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。
1.2方法
1.2.1逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) CIN各組患者取病變組織標本2份，對照組任取宮頸組織2份；生理鹽水沖洗後，1份行常規病理檢查確診，1份置於-70 ℃冰箱中待檢。採用Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)提取組織總RNA，應用RT-PCR試劑盒(購自上海生物工程有限公司)逆轉錄合成cDNA，在PCR擴增儀上進行PCR反應。以β-action為內參照，與目的基因同一程序同時擴增。94 ℃變性45 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5min，共30個循環，最後72 ℃延伸7 min。取10 μLPCR擴增產物，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，後溴化乙錠(0.5 mg/mL)染色。紫外線觀測儀檢查有無特異條帶並攝影，有目的基因條帶及內參條帶者為陽性表達，只有內參條帶者為陰性表達，用圖像分析系統(HPIAS-1000)進行圖像掃描分析。檢測擴增產物含量以MarkerⅠ為分子量標準，目的基因mRNA表達水平=目的基因的灰度值/β-action的灰度值×100%。目的基因和β-action基因序列見表1。
1.2.2 參數比較 記錄各個因子(MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2) mRNA的陽性表達率和表達水平。比較各組患者相關因子mRNA表達情況差異。
1.3統計學方法
應用spss 17.0軟體進行統計學分析，數值以(mean±SD)表示。數值變量採用兩隨機樣本t檢驗和方差分析，分類變量採用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1各組患者MMP-2和MMP-9 mRNA的表達情況比較
CINⅢ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅠ組和對照組患者在MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平方面無顯著性差異(P>0.05)。見表2、表3。
2.2 各組患者TIMP-2和TIMP-1 mRNA的表達情況比較
CINⅢ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平分別顯著低於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平顯著低於對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的表達水平顯著低於CINⅠ組(P<0.05)，而兩組患者在TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率方面無顯著性差異(P>0.05)。CINⅠ組和對照組患者在TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平方面無顯著性差異(P>0.05)。見表2、表3。
註：表示與CINⅡ組相比，＆P<0.05；表示與CINⅢ組相比，§P<0.05。
表3 各組相關因子的表達水平（x±s）
註：表示與CINⅡ組相比，＆P<0.05；表示與CINⅢ組相比，§P<0.05。
3討論
CIN是宮頸浸潤癌的癌前期病變，患者多無特異性的臨床表現，確診主要依靠組織學檢查。根據宮頸上皮細胞不典型增生的程度，CIN分為I、II、III級，每個級別的患者都有可能發生癌變，通常來講，級別高的患者發生癌變的可能性較高，級別低的患者發生自然退縮的機率較高。MMPs/TIMPs是調節細胞外基質穩態的重要因子，其與腫瘤的發生、進展密切相關。因此，分析MMPs和TIMPs在各級CIN患者中的表達情況有助於揭示CIN進展和宮頸浸潤癌發生的機制。
MMPs是一種降解細胞外基質的蛋白水解酶，可以破壞基底膜屏障及局部的組織結構。正常情況下MMPs的活性和表達水平較低，當機體出現病理狀態時或者受到某種刺激的情況下其表達水平會升高。有報道稱，CIN組織具有和正常宮頸組織相似的完整基底膜，但其組織或結構發生了不同程度的異常；而宮頸癌組織的基底膜受損嚴重，大部分基底膜丟失[3]。另有報道稱，在宮頸癌形成的早期即可發現MMP-2表達的異常，CIN患者MMP-2的陽性表達率顯著高於正常人[4]。
范懿雋等[5]研究顯示，MMP-2在CIN組織中呈高表達，明顯高於正常對照組，隨著CIN級別增加其表達水平增高。本研究發現，CINⅢ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組；CINⅡ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅠ組和對照組。與上述研究結果不盡一致，提示隨著CIN分級的升高，MMP-2和MMP-9表達水平增加，此可能與CIN的發生、進展有關，二者表達水平可作為判斷CIN病情、評估預後的參考指標。
TIMPs是體內MMP的天然抑制物，主要是由結締組織和巨噬細胞產生，廣泛分布於各種組織和體液中，其主要功能是與MMPs結合，使MMPs喪失活性，調節細胞外基質的代謝。有報道稱，宮頸原位癌(CINⅢ)患者TIMP-1和TIMP-2的陽性表達率顯著高於正常對照組[6]。尹香花等[7]報道稱，宮頸癌患者TIMP-2表達陽性率顯著高於CIN患者和宮頸炎患者，而CIN患者TIMP-2表達陽性率與宮頸炎患者無顯著性差異。張天峰等[8]研究顯示，CINⅢ患者TIMP-2的表達高於CINⅡ、CINⅠ和柱狀上皮異位患者，而CINⅡ、CINⅠ和柱狀上皮異位患者之間TIMP-2的表達無顯著性差異。本研究發現，CINⅢ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平分別顯著低於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組；CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的表達水平顯著低於對照組和CINⅠ組。與上述研究結果不盡一致，這可能與研究樣本量有關；此結果提示TIMP-2和TIMP-1表達水平下調，可能與CIN的生物學行為相關，在CIN的發生、進展中起著重要作用。
綜述所述，隨著CIN分級的升高，MMP-2和MMP-9表達水平上調、TIMP-2和TIMP-1表達下調。MMPs/TIMPs表達變化可能與CIN的生物學行為相關，在CIN的發生、進展中起著重要作用，可作為判斷CIN病情、評估預後的參考指標。
[
參考文獻]
[1] 衷筱琴,蔡紅平,肖雯,等. CD44v6和MMP-9過表達與宮頸癌浸潤轉移的關係[J].中國婦幼保健,2009,24(34):4900-4903.
[2] 付曉瑞,張辰,陳長英,等.基質金屬蛋白酶及其抑制因子在非黑色素性皮膚癌中的表達及臨床意義[J].中華腫瘤雜誌,2012,34(5):369-373.
[3] 邵強,李芬芬,徐存栓.MMPs及TIMPs與婦科疾病的相關性[J].中國婦幼保健,2008,23(28): 4072-4074.
[4] 騰燕伊,劉曉雲,鄭洪,等.Ki-67、MMP-7、MMP-2在宮頸CIN和宮頸癌中的表達及意義[J].重慶醫科大學學報,2010,35(7):989-991.
[5] 范懿雋,周家德.MMP-2及CD147在宮頸上皮內瘤樣病變組織中的表達及意義[J].山東醫藥,2008,48(2):62-63.
[6] 南雲澤,劉麗利,林貞花,等.基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1、2在宮頸鱗癌中的表達及意義[J].天津醫藥,2011,39(2):105-107.
[7] 尹香花,隋玉梅,成艷,等.基質金屬蛋白酶MMP-2及其抑制物TIMP-2在宮頸癌中的表達[J].中國現代醫學雜誌,2012,22(15):15-18.
[8] 張天峰,林仲秋,張娟娟,等.基質金屬蛋白酶-2及其抑制因子在子宮頸上皮內瘤樣病變進展中的作用[J].中國婦幼保健,2010,25(10):1385-1388.
（收稿日期：2014-03-21）
1.鄭州大學第一附屬醫院婦產科，河南鄭州 450052;2.河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南鄭州 450052
[摘要] 目的 觀察基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9及其抑制因子1(TIMP-1)和TIMP-2在宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)中的表達情況，分析其臨床意義。方法 選取CIN患者78例，分為CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ三組。採用RT-PCR檢測組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的陽性表達率和表達水平。同時，選取正常宮頸組織標本30例為對照組。比較各組相關因子表達差異。結果 CINⅢ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組，TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平分別顯著低於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅠ組和對照組，CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的表達水平顯著低於CINⅠ組和對照組(P<0.05)。結論 MMP-2、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2表達變化可能在CIN的發生、進展中起著重要作用。
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關鍵詞 ] 基質金屬蛋白酶；基質金屬蛋白酶組織抑制物；宮頸上皮內瘤樣病變
[中圖分類號] R737.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2014）06（c）-0132-03
宮頸上皮內瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)是指宮頸不典型增生和宮頸原位癌，其為宮頸浸潤癌的癌前期病變。CIN進展演變為宮頸癌是一個連續的過程，明確CIN進展的分子機制對宮頸癌的預防和治療具有重要的意義。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一種可降解ECM的蛋白水解酶，與乳腺癌、胃癌、直腸癌等多種腫瘤的浸潤轉移密切相關；基質金屬蛋白酶組織抑制物(tissu inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMPs)是MMPs的天然抑制劑，與MMPs結合抑制其活性[1]。目前，已有文獻報道MMPs和TIMPs與宮頸癌的發生、發展有關[2]，但其在CIN各級中的表達情況尚不完全清楚。本研究分析了MMP-2、MMP-9及其抑制因子TIMP-1、TIMP-2在CIN中的表達情況及其臨床意義，報道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2010年2月—2013年12月我院診治的宮頸上皮內瘤樣病變患者78例。年齡26～41歲，平均(34±2.9)歲。其中，CINⅠ級患者19例(CINⅠ組)、CINⅡ級患者28例(CINⅡ組)和CINⅢ級患者31例(CINⅢ組)。所有患者術前均未接受過放療、化療、免疫、冷凍和雷射等治療，經病理學確診。同時，取同期行手術治療的正常宮頸組織標本30例為對照組，年齡28～45歲，平均(36.5±3.8)歲。各組患者在年齡方面無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。
1.2方法
1.2.1逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) CIN各組患者取病變組織標本2份，對照組任取宮頸組織2份；生理鹽水沖洗後，1份行常規病理檢查確診，1份置於-70 ℃冰箱中待檢。採用Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)提取組織總RNA，應用RT-PCR試劑盒(購自上海生物工程有限公司)逆轉錄合成cDNA，在PCR擴增儀上進行PCR反應。以β-action為內參照，與目的基因同一程序同時擴增。94 ℃變性45 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5min，共30個循環，最後72 ℃延伸7 min。取10 μLPCR擴增產物，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，後溴化乙錠(0.5 mg/mL)染色。紫外線觀測儀檢查有無特異條帶並攝影，有目的基因條帶及內參條帶者為陽性表達，只有內參條帶者為陰性表達，用圖像分析系統(HPIAS-1000)進行圖像掃描分析。檢測擴增產物含量以MarkerⅠ為分子量標準，目的基因mRNA表達水平=目的基因的灰度值/β-action的灰度值×100%。目的基因和β-action基因序列見表1。
1.2.2 參數比較 記錄各個因子(MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2) mRNA的陽性表達率和表達水平。比較各組患者相關因子mRNA表達情況差異。
1.3統計學方法
應用spss 17.0軟體進行統計學分析，數值以(mean±SD)表示。數值變量採用兩隨機樣本t檢驗和方差分析，分類變量採用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1各組患者MMP-2和MMP-9 mRNA的表達情況比較
CINⅢ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅠ組和對照組患者在MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平方面無顯著性差異(P>0.05)。見表2、表3。
2.2 各組患者TIMP-2和TIMP-1 mRNA的表達情況比較
CINⅢ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平分別顯著低於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平顯著低於對照組(P<0.05)。CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的表達水平顯著低於CINⅠ組(P<0.05)，而兩組患者在TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率方面無顯著性差異(P>0.05)。CINⅠ組和對照組患者在TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平方面無顯著性差異(P>0.05)。見表2、表3。
註：表示與CINⅡ組相比，＆P<0.05；表示與CINⅢ組相比，§P<0.05。
表3 各組相關因子的表達水平（x±s）
註：表示與CINⅡ組相比，＆P<0.05；表示與CINⅢ組相比，§P<0.05。
3討論
CIN是宮頸浸潤癌的癌前期病變，患者多無特異性的臨床表現，確診主要依靠組織學檢查。根據宮頸上皮細胞不典型增生的程度，CIN分為I、II、III級，每個級別的患者都有可能發生癌變，通常來講，級別高的患者發生癌變的可能性較高，級別低的患者發生自然退縮的機率較高。MMPs/TIMPs是調節細胞外基質穩態的重要因子，其與腫瘤的發生、進展密切相關。因此，分析MMPs和TIMPs在各級CIN患者中的表達情況有助於揭示CIN進展和宮頸浸潤癌發生的機制。
MMPs是一種降解細胞外基質的蛋白水解酶，可以破壞基底膜屏障及局部的組織結構。正常情況下MMPs的活性和表達水平較低，當機體出現病理狀態時或者受到某種刺激的情況下其表達水平會升高。有報道稱，CIN組織具有和正常宮頸組織相似的完整基底膜，但其組織或結構發生了不同程度的異常；而宮頸癌組織的基底膜受損嚴重，大部分基底膜丟失[3]。另有報道稱，在宮頸癌形成的早期即可發現MMP-2表達的異常，CIN患者MMP-2的陽性表達率顯著高於正常人[4]。
范懿雋等[5]研究顯示，MMP-2在CIN組織中呈高表達，明顯高於正常對照組，隨著CIN級別增加其表達水平增高。本研究發現，CINⅢ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組；CINⅡ組患者MMP-2、MMP-9的陽性表達率和表達水平分別顯著高於CINⅠ組和對照組。與上述研究結果不盡一致，提示隨著CIN分級的升高，MMP-2和MMP-9表達水平增加，此可能與CIN的發生、進展有關，二者表達水平可作為判斷CIN病情、評估預後的參考指標。
TIMPs是體內MMP的天然抑制物，主要是由結締組織和巨噬細胞產生，廣泛分布於各種組織和體液中，其主要功能是與MMPs結合，使MMPs喪失活性，調節細胞外基質的代謝。有報道稱，宮頸原位癌(CINⅢ)患者TIMP-1和TIMP-2的陽性表達率顯著高於正常對照組[6]。尹香花等[7]報道稱，宮頸癌患者TIMP-2表達陽性率顯著高於CIN患者和宮頸炎患者，而CIN患者TIMP-2表達陽性率與宮頸炎患者無顯著性差異。張天峰等[8]研究顯示，CINⅢ患者TIMP-2的表達高於CINⅡ、CINⅠ和柱狀上皮異位患者，而CINⅡ、CINⅠ和柱狀上皮異位患者之間TIMP-2的表達無顯著性差異。本研究發現，CINⅢ組患者TIMP-2、TIMP-1的陽性表達率和表達水平分別顯著低於CINⅡ組、CINⅠ組和對照組；CINⅡ組患者TIMP-2、TIMP-1的表達水平顯著低於對照組和CINⅠ組。與上述研究結果不盡一致，這可能與研究樣本量有關；此結果提示TIMP-2和TIMP-1表達水平下調，可能與CIN的生物學行為相關，在CIN的發生、進展中起著重要作用。
綜述所述，隨著CIN分級的升高，MMP-2和MMP-9表達水平上調、TIMP-2和TIMP-1表達下調。MMPs/TIMPs表達變化可能與CIN的生物學行為相關，在CIN的發生、進展中起著重要作用，可作為判斷CIN病情、評估預後的參考指標。
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參考文獻]
[1] 衷筱琴,蔡紅平,肖雯,等. CD44v6和MMP-9過表達與宮頸癌浸潤轉移的關係[J].中國婦幼保健,2009,24(34):4900-4903.
[2] 付曉瑞,張辰,陳長英,等.基質金屬蛋白酶及其抑制因子在非黑色素性皮膚癌中的表達及臨床意義[J].中華腫瘤雜誌,2012,34(5):369-373.
[3] 邵強,李芬芬,徐存栓.MMPs及TIMPs與婦科疾病的相關性[J].中國婦幼保健,2008,23(28): 4072-4074.
[4] 騰燕伊,劉曉雲,鄭洪,等.Ki-67、MMP-7、MMP-2在宮頸CIN和宮頸癌中的表達及意義[J].重慶醫科大學學報,2010,35(7):989-991.
[5] 范懿雋,周家德.MMP-2及CD147在宮頸上皮內瘤樣病變組織中的表達及意義[J].山東醫藥,2008,48(2):62-63.
[6] 南雲澤,劉麗利,林貞花,等.基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1、2在宮頸鱗癌中的表達及意義[J].天津醫藥,2011,39(2):105-107.
[7] 尹香花,隋玉梅,成艷,等.基質金屬蛋白酶MMP-2及其抑制物TIMP-2在宮頸癌中的表達[J].中國現代醫學雜誌,2012,22(15):15-18.
[8] 張天峰,林仲秋,張娟娟,等.基質金屬蛋白酶-2及其抑制因子在子宮頸上皮內瘤樣病變進展中的作用[J].中國婦幼保健,2010,25(10):1385-1388.
（收稿日期：2014-03-21）
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