【摘要】 目的測定20種中藥飲片中蘆丁的含量。方法採用反相高效液相色譜法，以Hypersil GOLD柱（5μm 250mm×4.60mm）為 分析 柱，乙腈∶水 （加磷酸調pH至2.6）（8∶92～30∶70）為流動相，流速：0.8ml/min；檢測波長為254nm，柱溫30℃。結果蘆丁濃度在（0.0095～0.3800）μg範圍內與色譜峰面積呈良好的線性關係。結論該方法簡易準確，重現性好，在本色譜條件及樣品處理方法下，可以準確測出該20種中藥飲片中蘆丁的含量。
【關鍵詞】中藥；蘆丁；高效液相色譜法
【Abstract】 ObjectiveTo establish HPLC method for determination of the content of rutin in 20 kinds of Chinese herbal medicines.MethodsThe HPLC was conducted on a Hypersil GOLD column(5μm，250mm×4.6mm)with acetonitrile-water solution (8∶92～30∶70). The solution was adjusted to pH 2.6 with phosphoric acid and used as mobile phase with the flow rate of 0.8ml/min. The detective wavelength was set to 254 nm and column temperature at 30℃.ResultsThe area under the peak of chromatography is very well correlated with the concentration of rutin in the range of（0.0095～0.3800）μg.ConclusionThis method is simple and accurate. The experimental results are very reproducible. Under the conditions as stated in the method section， the rutin can be separated very well from 20 kinds of Chinese herbal medicines. The concentration of the Rutin， therefore， can be accurately determined.
【Key words】Chinese herbal medicines；rutin；HPLC
蘆丁，即芸香苷，是中藥飲片中較多見的一種黃酮類成分，有抗炎、降血脂、抗病毒及維生素P樣等作用。有關蘆丁的HPLC測試方法已有很多報道［1～3］，筆者採用反相高效液相色譜法在50餘種常用中藥飲片中分離、檢測蘆丁成分，經在時間軸上（調節色譜條件以使出峰保留時間在10～35min範圍內改變）反覆與蘆丁對照品比較，最後確認其中的20種中藥飲片中含有較高的黃酮類物質蘆丁。 文獻 曾報道該20種藥材中的8種含有蘆丁［3，4］，但具體含量不詳，筆者查閱國內有關文獻，未發現在另12種藥材中也含有蘆丁的最新報道。實驗結果可供有關科研和臨床工作者 參考 。
1 實驗 研究
1.1儀器和試藥 Waters高效液相色譜儀，包括510泵，484紫外檢測器，680梯度控制器。浙江大學N2000色譜工作站。
蘆丁對照品（ 中國 藥品生物製品檢定所），50種藥材樣品分3次每次50種分別購自浙江中醫學院實驗藥廠、浙江省中 醫院 和浙江中醫學院門診部。經浙江中醫學院中藥鑑定教研室陳錫林副教授和浙江中醫學院實驗藥廠張雲副主任藥師鑑定並確認。乙腈為色譜醇，磷酸為分析醇，水為純凈水。
1.2色譜條件 Hypersil GOLD柱（5μm 250mm×4.6mm）；流動相：乙腈∶水（8∶92～30∶70)，加磷酸調pH至2.6；流速：0.8ml/min；檢測波長為254nm，柱溫為30℃。
1.3對照品溶液配製 精密稱取蘆丁對照品1.9mg，置 10ml量瓶中，加甲醇至刻度，置超聲波中振蕩溶解，精密吸取該標準溶液0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml，置1ml定量管中，用淋洗液稀釋至刻度備用。
1.4樣品處理 取上述三批50種藥材的乾燥樣品各50g，打成粗粉，對應混合，各稱取3份，每份2g，置150隻100ml大口瓶中，各加50ml甲醇，超聲波中振搖15min後浸泡過夜，吸取上清液，經離心，0.45μm濾膜過濾，C18固相萃取器萃取後，用淋洗液稀釋5倍待測。
1.5定性分析 調整流動相中乙腈和水的比例，使蘆丁標準品的出峰時間控制在10min左右，取上述各待測樣品，吸取5μl進樣，初步確定該條件下的樣品峰型後，加適量蘆丁對照品稀釋液於該待測樣品中（使樣品中的對應蘆丁峰面積增大1～2倍），再逐次調整流動相比例，使蘆丁的出峰時間從10～35min不斷延後，觀察每次進樣出峰時蘆丁標準峰與樣品中的蘆丁特定峰是否完全重疊或重疊峰中有肩峰出現，經反覆比較，觀察全過程中重疊峰形態完好的，無肩峰或樣品中的特定峰出現再分離現象的樣品，由此確定其蘆丁的成分，見圖1。圖1是苦丁茶樣品及加蘆丁標準品後的對照圖譜。上述50種被測樣品中，符合該定性分析要求的樣品有20種。
A.苦丁茶樣品(Herba Corydalis bungeanae)
B.苦丁樣品+蘆丁對照品(Herba Cordalis bungeanae+reference substance of Rutin)
1.蘆丁(Rutin)
圖1 色譜圖
1.6線性範圍 精密吸取3種蘆丁對照品稀釋液各5μl 進樣（流動相中的乙腈和水的比例視藥材的峰型而定，其他條件不變。對上述含蘆丁的20種藥材每種都作出其相應的回歸方程，這裡僅列出3個特殊點上的回歸方程Y1、Y2和Y3），記錄峰面積，重複3次取平均值。以對照品溶液濃度（X）與其相應峰面積（Y）求得回歸方程和相關係數為：
Y1=1.484×106X+1420，r=0.9999。（乙腈∶水=30∶70）
Y2=1.405×106X+1685，r=0.9998。（乙腈∶水=20∶80）
Y3=1.316×106X+1329，r=0.9999。（乙腈∶水=10∶90）
線性範圍：0.0095μg～0.3800μg
1.7回收率測試 稱取符合定性要求的20種樣品粉末各2g 3份，置60隻100ml量瓶中，選擇3種上述稀釋的對照品溶液，分別加入1ml，同樣品處理方法處理後進樣，記錄峰面積，同時以同種相同量對照品稀釋液直接進樣的峰面積為對照， 計算 回收率。測得20種試液的平均回收率見表1，RSD值見表1中RSD1。
1.8精密度、重複性及穩定性測試 取標準品稀釋液中的一種，精密吸取5μl，在各色譜條件下連續進樣5次，測得峰面積積分值的RSD見表1中RSD2；取上述20種樣品待測液，各精密吸取5μl，連續進樣5次，測得峰面積積分值的RSD見表1中RSD3；取上述20種樣品待測液，每隔4h各精密吸取5μl進樣，連續5次，測得峰面積積分值的RSD見表1中RSD4。
【關鍵詞】中藥；蘆丁；高效液相色譜法
【Abstract】 ObjectiveTo establish HPLC method for determination of the content of rutin in 20 kinds of Chinese herbal medicines.MethodsThe HPLC was conducted on a Hypersil GOLD column(5μm，250mm×4.6mm)with acetonitrile-water solution (8∶92～30∶70). The solution was adjusted to pH 2.6 with phosphoric acid and used as mobile phase with the flow rate of 0.8ml/min. The detective wavelength was set to 254 nm and column temperature at 30℃.ResultsThe area under the peak of chromatography is very well correlated with the concentration of rutin in the range of（0.0095～0.3800）μg.ConclusionThis method is simple and accurate. The experimental results are very reproducible. Under the conditions as stated in the method section， the rutin can be separated very well from 20 kinds of Chinese herbal medicines. The concentration of the Rutin， therefore， can be accurately determined.
【Key words】Chinese herbal medicines；rutin；HPLC
蘆丁，即芸香苷，是中藥飲片中較多見的一種黃酮類成分，有抗炎、降血脂、抗病毒及維生素P樣等作用。有關蘆丁的HPLC測試方法已有很多報道［1～3］，筆者採用反相高效液相色譜法在50餘種常用中藥飲片中分離、檢測蘆丁成分，經在時間軸上（調節色譜條件以使出峰保留時間在10～35min範圍內改變）反覆與蘆丁對照品比較，最後確認其中的20種中藥飲片中含有較高的黃酮類物質蘆丁。 文獻 曾報道該20種藥材中的8種含有蘆丁［3，4］，但具體含量不詳，筆者查閱國內有關文獻，未發現在另12種藥材中也含有蘆丁的最新報道。實驗結果可供有關科研和臨床工作者 參考 。
1 實驗 研究
1.1儀器和試藥 Waters高效液相色譜儀，包括510泵，484紫外檢測器，680梯度控制器。浙江大學N2000色譜工作站。
蘆丁對照品（ 中國 藥品生物製品檢定所），50種藥材樣品分3次每次50種分別購自浙江中醫學院實驗藥廠、浙江省中 醫院 和浙江中醫學院門診部。經浙江中醫學院中藥鑑定教研室陳錫林副教授和浙江中醫學院實驗藥廠張雲副主任藥師鑑定並確認。乙腈為色譜醇，磷酸為分析醇，水為純凈水。
1.2色譜條件 Hypersil GOLD柱（5μm 250mm×4.6mm）；流動相：乙腈∶水（8∶92～30∶70)，加磷酸調pH至2.6；流速：0.8ml/min；檢測波長為254nm，柱溫為30℃。
1.3對照品溶液配製 精密稱取蘆丁對照品1.9mg，置 10ml量瓶中，加甲醇至刻度，置超聲波中振蕩溶解，精密吸取該標準溶液0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml，置1ml定量管中，用淋洗液稀釋至刻度備用。
1.4樣品處理 取上述三批50種藥材的乾燥樣品各50g，打成粗粉，對應混合，各稱取3份，每份2g，置150隻100ml大口瓶中，各加50ml甲醇，超聲波中振搖15min後浸泡過夜，吸取上清液，經離心，0.45μm濾膜過濾，C18固相萃取器萃取後，用淋洗液稀釋5倍待測。
1.5定性分析 調整流動相中乙腈和水的比例，使蘆丁標準品的出峰時間控制在10min左右，取上述各待測樣品，吸取5μl進樣，初步確定該條件下的樣品峰型後，加適量蘆丁對照品稀釋液於該待測樣品中（使樣品中的對應蘆丁峰面積增大1～2倍），再逐次調整流動相比例，使蘆丁的出峰時間從10～35min不斷延後，觀察每次進樣出峰時蘆丁標準峰與樣品中的蘆丁特定峰是否完全重疊或重疊峰中有肩峰出現，經反覆比較，觀察全過程中重疊峰形態完好的，無肩峰或樣品中的特定峰出現再分離現象的樣品，由此確定其蘆丁的成分，見圖1。圖1是苦丁茶樣品及加蘆丁標準品後的對照圖譜。上述50種被測樣品中，符合該定性分析要求的樣品有20種。
A.苦丁茶樣品(Herba Corydalis bungeanae)
B.苦丁樣品+蘆丁對照品(Herba Cordalis bungeanae+reference substance of Rutin)
1.蘆丁(Rutin)
圖1 色譜圖
1.6線性範圍 精密吸取3種蘆丁對照品稀釋液各5μl 進樣（流動相中的乙腈和水的比例視藥材的峰型而定，其他條件不變。對上述含蘆丁的20種藥材每種都作出其相應的回歸方程，這裡僅列出3個特殊點上的回歸方程Y1、Y2和Y3），記錄峰面積，重複3次取平均值。以對照品溶液濃度（X）與其相應峰面積（Y）求得回歸方程和相關係數為：
Y1=1.484×106X+1420，r=0.9999。（乙腈∶水=30∶70）
Y2=1.405×106X+1685，r=0.9998。（乙腈∶水=20∶80）
Y3=1.316×106X+1329，r=0.9999。（乙腈∶水=10∶90）
線性範圍：0.0095μg～0.3800μg
1.7回收率測試 稱取符合定性要求的20種樣品粉末各2g 3份，置60隻100ml量瓶中，選擇3種上述稀釋的對照品溶液，分別加入1ml，同樣品處理方法處理後進樣，記錄峰面積，同時以同種相同量對照品稀釋液直接進樣的峰面積為對照， 計算 回收率。測得20種試液的平均回收率見表1，RSD值見表1中RSD1。
1.8精密度、重複性及穩定性測試 取標準品稀釋液中的一種，精密吸取5μl，在各色譜條件下連續進樣5次，測得峰面積積分值的RSD見表1中RSD2；取上述20種樣品待測液，各精密吸取5μl，連續進樣5次，測得峰面積積分值的RSD見表1中RSD3；取上述20種樣品待測液，每隔4h各精密吸取5μl進樣，連續5次，測得峰面積積分值的RSD見表1中RSD4。
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