作者：肖柳英，洪暉菁，潘競鏘，呂俊華，沈文娟
【摘要】
目的利用血清藥 理學 的方法，觀察荔枝核含藥血清體外的抑制腫瘤細胞生長；並研究荔枝核對小鼠S180，EAC體內、外細胞生長及凋亡作用。方法小鼠 S180，EAC細胞混懸液用生理鹽水按1:1進行稀釋製成含瘤腹水混懸液,在給藥前24 h,每隻小鼠腋窩皮下接種0.2 ml。荔枝核水提液對小鼠S180，EAC抑瘤實驗連續給藥10 d。測定腫瘤作用與細胞凋亡表達。結果荔枝核提取物30%含藥血清高中劑量和20%含藥血清高劑量對HepG2腫瘤細胞具有明顯的抑瘤作用， Hochest染色腫瘤細胞出現凋亡形態；而流式細胞儀檢測可見30%含藥血清高中低劑量的促腫瘤凋亡率分別是63.3%，45.5%和23.8%，明顯高於正常血清組。荔枝核水提物能夠明顯抑制S180，EAC腫瘤的生長（P<0.05），荔枝核提取物對荷S180小鼠高劑量組的抑瘤率達到32.81%。對荷EAC實體瘤小鼠的腫瘤其抑瘤率達到30.62%；結論荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC體內、外細胞生長的影響，促進腫瘤細胞的凋亡，從而表現抗腫瘤的作用。
【關鍵詞】 荔枝核 小鼠 S180 EAC 抑瘤作用 凋亡
荔枝核為無患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn的乾燥成熟種子。夏季採摘成熟果實，除去果皮及肉質假種皮，洗凈，曬乾［1］。荔枝及荔枝核的 經濟 和藥用價值逐漸受到關注,近幾年來已有多篇報道用荔枝核中藥 治療 糖尿病的經驗［2］，荔枝核具有調血脂、保肝以及抗氧化等作用［3，4］，特別是荔枝核的多糖成分在抗腫瘤、提高機體免疫活性方面具有較大的關注。基於以上的研究，本實驗進一步研究荔枝核對荷瘤小鼠體內、外細胞生長及誘導細胞凋亡的影響報道如下。
1 材料
1.1 動物清潔級 ，紐西蘭雄性大白兔,購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物質量合格證號：粵監證字2006A001。SPF級小鼠 ，購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物質量合格證號: 粵監證字2006A018。
1.2 儀器CO2恆溫培養箱（Thermo fora美國）；AIR TECH型醫用超凈台（蘇凈集團安泰公司）；XSZ-D型倒置生物顯微鏡(重慶光學儀器廠)；螢光顯微鏡（Olympus Japan）；BIO-RAD-450型酶標定量測試儀（美國）；流式細胞儀（FACSCalibur型Becton Dickinson）；BIO-RAD 電泳儀（美國）；Eppendorf 低溫高速冷凍離心機（德國）。
1.3 試藥荔枝核提取物：顆粒（顆粒∶生藥＝1∶10），廣東一方製藥業有限公司；批號（0604229）。
環磷醯胺（CTX）：江蘇恆瑞醫藥股份有限公司，批號：05010821。
RPIM 1640培養液（GIBCO公司產品），批號1285082；青黴素、鏈黴素（廣州白雲山天心製藥股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司產品），批號060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生產）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，SIGMA公司產品）；二甲基亞碸（DMSO；美國Amresco公司產品）；Hochest33258(碧雲天生物技術公司)；PI染料 sigma；細胞裂解液(碧雲天生物技術公司)； BAX抗體（cell signaling）； BCL-2抗體（santa cruz）；GAPDH抗體（Chemicon）；ECL發光液；pierce 批號：HI106361 ；丙烯醯胺 sigma ; 甲叉丙烯醯胺 sigma ；SDS-十二烷基磺酸鈉sigma；甘氨酸 Biorad；TWEEN-20 sigma；TRIS-BASE sigma;TRIS sigma ;脫脂奶粉sigma ;NC膜minipore; WHATMAN濾紙 whatman。
2 方法
2.1 實驗技術路線
2.1.1 離體細胞實驗
2.1.2 在體動物實驗
2.2 含藥血清的製備按李儀奎等［5］方法製備含藥血清：將體重約1.5 kg的健康雄性紐西蘭大白兔10隻隨機分為荔枝核顆粒劑高、中、低劑量組和環磷醯胺（陽性對照）組，另設生理鹽水（空白對照）組，共5組，每組2隻。荔枝核顆粒劑高、中、低劑量組給藥劑量分別為168，84，42 g·kg-1·d-1，環磷醯胺組給藥劑量為42.4 g·kg-1·d-1，空白對照組給予等體積生理鹽水。各組動物每天灌胃給藥或生理鹽水，2次/d，每次間隔12 h，灌藥前4h禁食不禁水，連續3 d，末次灌胃1 h後，3%戊巴比妥鈉麻醉，頸動脈采血，4℃下靜置4 h，3 000 r·min-1離心15 min，無菌分離血清經56℃，30 min滅活處理後，0.20 μm微孔濾膜過濾除菌，置－20℃保存備用。
2.3 MTT法檢測含藥血清對 HepG2細胞的抑制率取對數生長期的細胞HepG2細胞，以3×104 ml-1的細胞濃度在96孔板上每孔接種100 μl，讓細胞貼壁生長24 h後，以不同濃度組含藥血清體積比分別為10%，20%，30%作用於細胞，每組濃度設4個復孔，培養72h後分別測細胞的生長抑制率，重複3次取平均值採用,結果見圖1;實驗結果表明：荔枝核提取物30%含藥血清高、中劑量和20%含藥血清高劑量對HepG2腫瘤細胞具有明顯的抑瘤作用。
2.4 Hochest33258染色檢測細胞凋亡將無菌的鋪有多聚賴氨酸蓋玻片置於六孔板內，以4×105 ml-1細胞接種24 h後， 加入含藥血清作用72h後，吸盡培養液，加入0.5 ml的固定液，固定10 min後，去固定液，用PBS洗3遍，5 min/次，加入0.5 ml Hochest33258染色液，染色5 min，邊晃動邊染色。抗淬滅液封片後，置螢光顯微鏡下觀察，拍片；結果見表1；實驗結果表明：其抑瘤作用機理可能與促進腫瘤細胞凋亡有關，如圖1可見，Hochest染色腫瘤細胞出現凋亡形態。 表1 荔枝核提取物含藥血清作用HepG2細胞72h的OD值(略)
2.5 流式細胞儀測定凋亡率取對數生長期的HepG2細胞，以4×105 ml-1到25 ml玻璃培養瓶，待其貼壁生長24 h後，加藥72 h後，胰酶消化，收集細胞，製成單細胞懸液，用冷PBS洗滌兩次，將細胞重懸於70%的冰乙醇固定24 h，離心棄乙醇，PBS洗滌1次，滴加已配好的200μl·ml-1 Rnase 0.5 ml，放置4 h以上，離心棄上清液，PBS洗滌1次，加0.5ml碘化丙錠（PI），過夜，離心棄PI，再用PBS洗滌1次，立即上機；結果見圖2和表2; 而流式細胞儀檢測可見30%含藥血清高中低劑量的促腫瘤凋亡率分別是63.3%，45.5%和23.8%，明顯高於正常血清組。
2.6 腫瘤模型的建立
2.6.1 小鼠S180，EAC移植性腫瘤模型［6］無菌抽取接種7 d後小鼠腹水,加生理鹽水稀釋使細胞密度達到2×106·ml-1於每隻小鼠右前肢腋窩處皮下常規接種一腫瘤細胞懸液0.2 ml，製成局灶性實體瘤模型。
2.6.2 動物分組及處理接種24 h後,隨機分成空白組、陽性對照組（CTX）、荔枝核高中低劑量組，每組10隻。空白組以0.1ml·（10 g）-1灌胃給以生理鹽水，陽性對照組CTX 25 mg·kg-1·d-1，荔枝核高劑量組62 g·kg-1·d-1，荔枝核中劑量組31 g·kg-1·d-1，荔枝核低劑量組15.5 g·kg-1·d-1。灌胃給藥1次/d，連續9 d，於第10天，將各組小鼠稱體重後處死,完整剝離瘤塊並稱重，按照公式:(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)100%/對照組平均瘤重, 計算 抑瘤率。結果（見表3～4）。實驗結果表明：荔枝核提取物對荷EAC實體瘤小鼠的腫瘤生長有一定的抑瘤作用，主要是高劑量組表現明顯，其抑瘤率達到30.62%；對荷S180小鼠高劑量組的抑瘤率達到32.81%。
2.7 Western blot 方法 檢測bcl-2 ,bax含量的表達［7］按試劑盒說明，提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白定量。
2.7.1 蛋白電泳SDS聚丙烯醯胺凝膠的配製：
①12%分離膠： 雙蒸水 3.35 ml; 1.5 mol/L Tris ( pH=8.8 ) 2.5 ml; 30%丙烯醯胺 4 ml；10%SDS 0.1 ml；10%過硫酸胺 50 μl；TEMED 5 μl (臨用前加入)；
②5%濃縮膠： 雙蒸水 3.4 ml; 0.5 mol/L Tris ( pH=6.8 ) 0.625 ml；30%丙烯醯胺 0.850 ml；10%SDS 0.05 ml；10%過硫酸胺 50 μl；TEMED 5 μl (臨用前加入)。
2.7.2 操作步驟①按說明書裝好電泳槽及玻璃板，同時做2塊膠，一塊染色，一塊轉膜；②確定所需凝膠的體積，按分離膠的配方依次混合各種成分，一旦加入TEMED後馬上開始聚合，故應該立即旋動混合物； ③迅速在2塊玻璃板的間隙中小心注入丙烯醯胺溶液，留出灌注濃縮膠的所需空間，並快速在膠的上方加滿雙蒸水，放置30min後用濾紙小心吸凈雙蒸水，用筆記錄分離膠的上緣；④按濃縮膠的配方製備濃縮膠，加入TEMED後，立即快速旋動混合物；⑤在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入乾淨的梳子，小心避免混入氣泡，室溫下放置15 min；⑥小心拔出梳子，按電泳裝置的要求進行安裝，加樣70 ug/孔；⑦電泳，濃縮膠中以80 V電泳約15 min，在溴酚藍跑到接近分離膠時改電壓為120 V，再繼續電泳約75 min；⑧電泳結束後，小心把膠從2塊玻璃中剝離出來，放入考馬斯藍染色液中，30 min後拿出，放入脫色液中直至背景褪色，蛋白條帶清晰為止。表2 荔枝核含藥血清對 HepG2細胞凋亡的影響結果（略）表3 荔枝核提取物對小鼠EAC實體瘤生長抑制作用(略)
2.7.3 蛋白的電轉移、抗體孵育和顯影①轉膜：戴手套切6張濾紙和1張NC膜，大小與凝膠完全一致，並置於轉移緩衝液中浸泡30 min。將3層濾紙、NC膜、凝膠、3層濾紙的順序排好，使之完全對齊，精確重疊，層間不留氣泡，並用鉛筆在一角做標記。按黑色板夾子→海綿墊→3層濾紙→凝膠→NC膜→3層濾紙→海綿墊→透明夾子的順序固定好，按紅黑方向放置於轉移槽中，往槽中加滿轉移緩衝液，接通電源，4℃，80 V轉移120 min，然後中止電源，取出NC膜進行雜交，並將凝膠轉至考馬斯亮蘭染料中進行染色，檢測蛋白是否轉移完全。轉印完畢將NC膜分為3塊，分別用TBST洗膜3次，10 min/次；② 封閉：用含有5%脫脂奶粉TBST 封閉放置於脫色搖床上，室溫反應120 min，並用TBST緩衝液將NC膜洗3次，10 min/次；③一塊用一抗anti-bcl-2，（1∶100TBS-5%milk-0.1%Tween20稀釋），一塊用anti-bax（二抗用羊抗兔），一塊用anti-GAPDH（二抗用羊抗鼠）（1∶1000TBS-5%milk-0.1%Tween20稀釋）4℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，10 min/次；④分別用鹼性磷酸酶標記的羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠二抗IgG-HRP，室溫緩慢震盪1 h後，TBST洗膜3次，每次10min；⑤將Westernblot化學螢光試劑A，B各500 μl等量混合後，於暗房，均勻加至膜上反應3 min，X光片曝光，凝膠圖像分析儀掃描圖像。表4 荔枝核提取物對小鼠S180實體瘤生長抑制作用(略)
通過Western blot分析，結果見圖3～4，荔枝核對小鼠S180EAC細胞生長其抑瘤作用主要是通過促進促凋亡蛋白bax的表達，減少抑制凋亡蛋白bcl2的表達，從而促進腫瘤細胞的凋亡，而表現抗腫瘤作用。
【摘要】
目的利用血清藥 理學 的方法，觀察荔枝核含藥血清體外的抑制腫瘤細胞生長；並研究荔枝核對小鼠S180，EAC體內、外細胞生長及凋亡作用。方法小鼠 S180，EAC細胞混懸液用生理鹽水按1:1進行稀釋製成含瘤腹水混懸液,在給藥前24 h,每隻小鼠腋窩皮下接種0.2 ml。荔枝核水提液對小鼠S180，EAC抑瘤實驗連續給藥10 d。測定腫瘤作用與細胞凋亡表達。結果荔枝核提取物30%含藥血清高中劑量和20%含藥血清高劑量對HepG2腫瘤細胞具有明顯的抑瘤作用， Hochest染色腫瘤細胞出現凋亡形態；而流式細胞儀檢測可見30%含藥血清高中低劑量的促腫瘤凋亡率分別是63.3%，45.5%和23.8%，明顯高於正常血清組。荔枝核水提物能夠明顯抑制S180，EAC腫瘤的生長（P<0.05），荔枝核提取物對荷S180小鼠高劑量組的抑瘤率達到32.81%。對荷EAC實體瘤小鼠的腫瘤其抑瘤率達到30.62%；結論荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC體內、外細胞生長的影響，促進腫瘤細胞的凋亡，從而表現抗腫瘤的作用。
【關鍵詞】 荔枝核 小鼠 S180 EAC 抑瘤作用 凋亡
荔枝核為無患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn的乾燥成熟種子。夏季採摘成熟果實，除去果皮及肉質假種皮，洗凈，曬乾［1］。荔枝及荔枝核的 經濟 和藥用價值逐漸受到關注,近幾年來已有多篇報道用荔枝核中藥 治療 糖尿病的經驗［2］，荔枝核具有調血脂、保肝以及抗氧化等作用［3，4］，特別是荔枝核的多糖成分在抗腫瘤、提高機體免疫活性方面具有較大的關注。基於以上的研究，本實驗進一步研究荔枝核對荷瘤小鼠體內、外細胞生長及誘導細胞凋亡的影響報道如下。
1 材料
1.1 動物清潔級 ，紐西蘭雄性大白兔,購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物質量合格證號：粵監證字2006A001。SPF級小鼠 ，購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物質量合格證號: 粵監證字2006A018。
1.2 儀器CO2恆溫培養箱（Thermo fora美國）；AIR TECH型醫用超凈台（蘇凈集團安泰公司）；XSZ-D型倒置生物顯微鏡(重慶光學儀器廠)；螢光顯微鏡（Olympus Japan）；BIO-RAD-450型酶標定量測試儀（美國）；流式細胞儀（FACSCalibur型Becton Dickinson）；BIO-RAD 電泳儀（美國）；Eppendorf 低溫高速冷凍離心機（德國）。
1.3 試藥荔枝核提取物：顆粒（顆粒∶生藥＝1∶10），廣東一方製藥業有限公司；批號（0604229）。
環磷醯胺（CTX）：江蘇恆瑞醫藥股份有限公司，批號：05010821。
RPIM 1640培養液（GIBCO公司產品），批號1285082；青黴素、鏈黴素（廣州白雲山天心製藥股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司產品），批號060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生產）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，SIGMA公司產品）；二甲基亞碸（DMSO；美國Amresco公司產品）；Hochest33258(碧雲天生物技術公司)；PI染料 sigma；細胞裂解液(碧雲天生物技術公司)； BAX抗體（cell signaling）； BCL-2抗體（santa cruz）；GAPDH抗體（Chemicon）；ECL發光液；pierce 批號：HI106361 ；丙烯醯胺 sigma ; 甲叉丙烯醯胺 sigma ；SDS-十二烷基磺酸鈉sigma；甘氨酸 Biorad；TWEEN-20 sigma；TRIS-BASE sigma;TRIS sigma ;脫脂奶粉sigma ;NC膜minipore; WHATMAN濾紙 whatman。
2 方法
2.1 實驗技術路線
2.1.1 離體細胞實驗
2.1.2 在體動物實驗
2.2 含藥血清的製備按李儀奎等［5］方法製備含藥血清：將體重約1.5 kg的健康雄性紐西蘭大白兔10隻隨機分為荔枝核顆粒劑高、中、低劑量組和環磷醯胺（陽性對照）組，另設生理鹽水（空白對照）組，共5組，每組2隻。荔枝核顆粒劑高、中、低劑量組給藥劑量分別為168，84，42 g·kg-1·d-1，環磷醯胺組給藥劑量為42.4 g·kg-1·d-1，空白對照組給予等體積生理鹽水。各組動物每天灌胃給藥或生理鹽水，2次/d，每次間隔12 h，灌藥前4h禁食不禁水，連續3 d，末次灌胃1 h後，3%戊巴比妥鈉麻醉，頸動脈采血，4℃下靜置4 h，3 000 r·min-1離心15 min，無菌分離血清經56℃，30 min滅活處理後，0.20 μm微孔濾膜過濾除菌，置－20℃保存備用。
2.3 MTT法檢測含藥血清對 HepG2細胞的抑制率取對數生長期的細胞HepG2細胞，以3×104 ml-1的細胞濃度在96孔板上每孔接種100 μl，讓細胞貼壁生長24 h後，以不同濃度組含藥血清體積比分別為10%，20%，30%作用於細胞，每組濃度設4個復孔，培養72h後分別測細胞的生長抑制率，重複3次取平均值採用,結果見圖1;實驗結果表明：荔枝核提取物30%含藥血清高、中劑量和20%含藥血清高劑量對HepG2腫瘤細胞具有明顯的抑瘤作用。
2.4 Hochest33258染色檢測細胞凋亡將無菌的鋪有多聚賴氨酸蓋玻片置於六孔板內，以4×105 ml-1細胞接種24 h後， 加入含藥血清作用72h後，吸盡培養液，加入0.5 ml的固定液，固定10 min後，去固定液，用PBS洗3遍，5 min/次，加入0.5 ml Hochest33258染色液，染色5 min，邊晃動邊染色。抗淬滅液封片後，置螢光顯微鏡下觀察，拍片；結果見表1；實驗結果表明：其抑瘤作用機理可能與促進腫瘤細胞凋亡有關，如圖1可見，Hochest染色腫瘤細胞出現凋亡形態。 表1 荔枝核提取物含藥血清作用HepG2細胞72h的OD值(略)
2.5 流式細胞儀測定凋亡率取對數生長期的HepG2細胞，以4×105 ml-1到25 ml玻璃培養瓶，待其貼壁生長24 h後，加藥72 h後，胰酶消化，收集細胞，製成單細胞懸液，用冷PBS洗滌兩次，將細胞重懸於70%的冰乙醇固定24 h，離心棄乙醇，PBS洗滌1次，滴加已配好的200μl·ml-1 Rnase 0.5 ml，放置4 h以上，離心棄上清液，PBS洗滌1次，加0.5ml碘化丙錠（PI），過夜，離心棄PI，再用PBS洗滌1次，立即上機；結果見圖2和表2; 而流式細胞儀檢測可見30%含藥血清高中低劑量的促腫瘤凋亡率分別是63.3%，45.5%和23.8%，明顯高於正常血清組。
2.6 腫瘤模型的建立
2.6.1 小鼠S180，EAC移植性腫瘤模型［6］無菌抽取接種7 d後小鼠腹水,加生理鹽水稀釋使細胞密度達到2×106·ml-1於每隻小鼠右前肢腋窩處皮下常規接種一腫瘤細胞懸液0.2 ml，製成局灶性實體瘤模型。
2.6.2 動物分組及處理接種24 h後,隨機分成空白組、陽性對照組（CTX）、荔枝核高中低劑量組，每組10隻。空白組以0.1ml·（10 g）-1灌胃給以生理鹽水，陽性對照組CTX 25 mg·kg-1·d-1，荔枝核高劑量組62 g·kg-1·d-1，荔枝核中劑量組31 g·kg-1·d-1，荔枝核低劑量組15.5 g·kg-1·d-1。灌胃給藥1次/d，連續9 d，於第10天，將各組小鼠稱體重後處死,完整剝離瘤塊並稱重，按照公式:(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)100%/對照組平均瘤重, 計算 抑瘤率。結果（見表3～4）。實驗結果表明：荔枝核提取物對荷EAC實體瘤小鼠的腫瘤生長有一定的抑瘤作用，主要是高劑量組表現明顯，其抑瘤率達到30.62%；對荷S180小鼠高劑量組的抑瘤率達到32.81%。
2.7 Western blot 方法 檢測bcl-2 ,bax含量的表達［7］按試劑盒說明，提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白定量。
2.7.1 蛋白電泳SDS聚丙烯醯胺凝膠的配製：
①12%分離膠： 雙蒸水 3.35 ml; 1.5 mol/L Tris ( pH=8.8 ) 2.5 ml; 30%丙烯醯胺 4 ml；10%SDS 0.1 ml；10%過硫酸胺 50 μl；TEMED 5 μl (臨用前加入)；
②5%濃縮膠： 雙蒸水 3.4 ml; 0.5 mol/L Tris ( pH=6.8 ) 0.625 ml；30%丙烯醯胺 0.850 ml；10%SDS 0.05 ml；10%過硫酸胺 50 μl；TEMED 5 μl (臨用前加入)。
2.7.2 操作步驟①按說明書裝好電泳槽及玻璃板，同時做2塊膠，一塊染色，一塊轉膜；②確定所需凝膠的體積，按分離膠的配方依次混合各種成分，一旦加入TEMED後馬上開始聚合，故應該立即旋動混合物； ③迅速在2塊玻璃板的間隙中小心注入丙烯醯胺溶液，留出灌注濃縮膠的所需空間，並快速在膠的上方加滿雙蒸水，放置30min後用濾紙小心吸凈雙蒸水，用筆記錄分離膠的上緣；④按濃縮膠的配方製備濃縮膠，加入TEMED後，立即快速旋動混合物；⑤在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入乾淨的梳子，小心避免混入氣泡，室溫下放置15 min；⑥小心拔出梳子，按電泳裝置的要求進行安裝，加樣70 ug/孔；⑦電泳，濃縮膠中以80 V電泳約15 min，在溴酚藍跑到接近分離膠時改電壓為120 V，再繼續電泳約75 min；⑧電泳結束後，小心把膠從2塊玻璃中剝離出來，放入考馬斯藍染色液中，30 min後拿出，放入脫色液中直至背景褪色，蛋白條帶清晰為止。表2 荔枝核含藥血清對 HepG2細胞凋亡的影響結果（略）表3 荔枝核提取物對小鼠EAC實體瘤生長抑制作用(略)
2.7.3 蛋白的電轉移、抗體孵育和顯影①轉膜：戴手套切6張濾紙和1張NC膜，大小與凝膠完全一致，並置於轉移緩衝液中浸泡30 min。將3層濾紙、NC膜、凝膠、3層濾紙的順序排好，使之完全對齊，精確重疊，層間不留氣泡，並用鉛筆在一角做標記。按黑色板夾子→海綿墊→3層濾紙→凝膠→NC膜→3層濾紙→海綿墊→透明夾子的順序固定好，按紅黑方向放置於轉移槽中，往槽中加滿轉移緩衝液，接通電源，4℃，80 V轉移120 min，然後中止電源，取出NC膜進行雜交，並將凝膠轉至考馬斯亮蘭染料中進行染色，檢測蛋白是否轉移完全。轉印完畢將NC膜分為3塊，分別用TBST洗膜3次，10 min/次；② 封閉：用含有5%脫脂奶粉TBST 封閉放置於脫色搖床上，室溫反應120 min，並用TBST緩衝液將NC膜洗3次，10 min/次；③一塊用一抗anti-bcl-2，（1∶100TBS-5%milk-0.1%Tween20稀釋），一塊用anti-bax（二抗用羊抗兔），一塊用anti-GAPDH（二抗用羊抗鼠）（1∶1000TBS-5%milk-0.1%Tween20稀釋）4℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，10 min/次；④分別用鹼性磷酸酶標記的羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠二抗IgG-HRP，室溫緩慢震盪1 h後，TBST洗膜3次，每次10min；⑤將Westernblot化學螢光試劑A，B各500 μl等量混合後，於暗房，均勻加至膜上反應3 min，X光片曝光，凝膠圖像分析儀掃描圖像。表4 荔枝核提取物對小鼠S180實體瘤生長抑制作用(略)
通過Western blot分析，結果見圖3～4，荔枝核對小鼠S180EAC細胞生長其抑瘤作用主要是通過促進促凋亡蛋白bax的表達，減少抑制凋亡蛋白bcl2的表達，從而促進腫瘤細胞的凋亡，而表現抗腫瘤作用。
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