摘要：植物溶菌酶是植物防禦體系中的一部分，在植物防衛體系中具有重要作用。蘿蔔中有2個具溶菌酶活性的幾丁質結合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs），分別是CBP1、CBP2組分。為了解CBPs的作用機制以及在蘿蔔中的生理功能，試驗研究了CBP1、CBP2溶菌酶組分酶活性的穩定性。結果顯示，CBP1、CBP2在pH 5.4、65 ℃條件下迅速失活，在pH 3.4～10.6、25 ℃條件下較穩定；CBP1較CBP2對氧化劑H2O2、NaClO敏感；CBP2較CBP1對木瓜蛋白酶敏感；2個組分對胰蛋白酶均敏感。
關鍵詞：蘿蔔；溶菌酶活性；幾丁質結合蛋白；穩定性
中圖分類號：S631.1；Q556+.2；Q946.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1330-04
溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）廣泛存在於生物體內，是一類專門作用於微生物細胞壁的水解酶，有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤，增強免疫力等作用，已在醫學、食品、化妝品、生物工程等多個領域得到廣泛應用[1]。對於溶菌酶的發現是從Nicolle 1907年發表枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）溶解因子的報告開始的[1]；而對於溶菌酶本質的研究則是在1922年Fleming等[2]發現人的鼻涕、唾液、眼淚具有較強的溶菌活性、並把起溶菌作用的因子命名為溶菌酶後開始的[3]。在眾多研究中，雞蛋清的溶菌酶（Hen-egg white lysozyme，HEWL）含量多，製備技術較成熟，所以研究較深入[4]。現在植物溶菌酶的研究也取得了很大進展，研究者們已經先後從無花果（Ficus carica L.）[5]、蕪菁（Brassica rapa L.）[6]、莧菜（Amaranthus mangostanus L.）[7]、花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）等植物的組織中及番木瓜（Carica papaya L.）[8]、大牛角瓜[Calotropis gigantea（L.）W. T. Aiton][9]、三葉橡膠樹[Hevea brasiliensis（Willd. ex A. Juss.）Muell. Arg.][10]、冠狀狗牙花[Ervatamia coronaria（Jacq.）Stap f.][11]、敘利亞馬利筋（Asclepias syriaca L.）[12]等植物的乳汁中和蘿蔔（Raphanus sativus L.）[13]塊根組織中提取到了溶菌酶；蘿蔔組織中有2個具有溶菌酶活性的幾丁質結合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs）組分，業界分別表述為CBP1、CBP2；其對進一步了解植物溶菌酶的作用機制和拓展植物溶菌酶的應用範圍具有一定的研究價值。為了弄清楚CBPs的作用機制以及在蘿蔔中的生理功能，試驗探討了CBPs溶菌酶活性在不同環境條件下的穩定性。現將結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
蘿蔔取自華南農業大學生命科學學院網室栽培的新鮮蘿蔔塊根；溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）採用美國Sigma公司產品；木瓜蛋白酶液自行配製，由1份木瓜蛋白酶加9份激活劑組成，激活劑含2 mmol/L乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、20 mmol/L半胱氨酸（Cysteine，Cys）；胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）和胰蛋白酶（10 mg/mL）由華南農業大學生命科學學院中心實驗室提供；不同pH的磷酸緩衝液自行配製，H2O2、NaClO等為分析純。
1.2 方法
1.2.1 具溶菌酶活性的CBPs分離及純化 參照文獻[13]的方法，將蘿蔔塊根洗凈、搗碎、離心、取上清，脫氨、再生、幾丁質凝膠親和層析、羧甲基纖維素層析柱離子交換層析，結果從蘿蔔塊根中分離到2個具溶菌酶活性的酶組分CBP1和CBP2，分別將兩者冷凍乾燥，得到粉末狀物質，可視為試驗所需的酶粉。
1.2.2 CBPs溶菌酶活性測定 取2個酶組分的酶粉，在25 ℃環境下，用pH 5.4、50 mmol/L的磷酸緩衝液溶解，配成2個酶組分的酶液，待用。參照文獻[13]的方法。用pH 6.2、50 mmol/L 磷酸緩衝液配製溶壁微球菌懸浮液，在30 ℃條件下取2.5 mL上述懸浮液於比色杯中，分別加入0.1 mL的2個酶組分酶液，迅速攪勻，以每分鐘在450 nm處使吸光度值下降0.001所需的酶量為一個酶活力單位（U）。
1.2.3 CBPs溶菌酶活性的酸鹼穩定性 取2個酶組分的酶粉，用不同pH的50 mmol/L磷酸緩衝液（pH 2.2～10.6、25 ℃）溶解，放置30 min，分別測定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個酶組分之間的酶相對活性。
1.2.4 CBPs溶菌酶活性的熱穩定性 2個酶組分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸緩衝液溶解，在不同溫度（0～80 ℃）下放置30 min，流水冷卻，分別測定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個酶組分之間的酶相對活性。
1.2.5 CBPs溶菌酶活性在氧化劑H2O2、NaClO中的穩定性 2個酶組分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸緩衝液溶解，分別加入不同終濃度的H2O2（分別配製成5、10、15、20、25 mmol/L梯度溶液）或NaClO（分別配製成5、10、15、20、25、30、35 μg/mL梯度溶液），25 ℃放置30 min，再分別測定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個酶組分之間的酶相對活性。
1.2.6 CBPs溶菌酶活性對蛋白酶的穩定性 分別在1 mL 2個酶組分酶液中加入1 mL木瓜蛋白酶液，37 ℃水浴10 min後分別測定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性；分別在1 mL 2個酶組分酶液中加入胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）或胰蛋白酶（10 mg/mL），經30 min後分別測定CBP1、CBP2組分在一定時間範圍（60 min）內的溶菌酶活性，比較2個酶組分之間的酶相對活性。
2 結果與分析
2.1 CBPs溶菌酶活性的酸鹼穩定性
CBPs溶菌酶活性的酸鹼穩定性測定結果見圖1。從圖1可見，在pH 2.2～pH 3.4時，CBP2溶菌酶組分的相對活性升幅小，而CBP1溶菌酶組分的相對活性升幅大；在pH 3.4～pH 10.6時，2個CBPs溶菌酶組分的相對活性都比較穩定；但在pH>10.6時，2個CBPs溶菌酶組分的相對活性迅速降低。
2.2 CBPs溶菌酶活性的熱穩定性
CBPs溶菌酶活性的熱穩定性測定結果見圖2。從圖2可見，在pH 5.4、0～55 ℃範圍內，CBPs溶菌酶活性對溫度不太敏感；60 ℃時，CBP1溶菌酶組分的酶相對活性迅速降低，CBP2溶菌酶組分仍殘餘75%的酶相對活性。繼續升高溫度到65 ℃，則2個CBPs溶菌酶組分的酶相對活性都急劇下降至0。
2.3 氧化劑對CBPs溶菌酶活性的影響
氧化劑對CBPs溶菌酶活性的影響結果見圖3。從圖3A可見，2個CBPs溶菌酶組分的酶相對活性對NaClO都很敏感，尤其是CBP1溶菌酶組分。從圖3B可見，H2O2對2個CBPs溶菌酶組分的酶相對活性影響呈現明顯的差異：其中CBP1溶菌酶組分的酶相對活性在H2O2中不穩定；CBP2溶菌酶組分的酶相對活性在低濃度的H2O2中穩定，當H2O2濃度升高至24 mmol/L時，則酶相對活性迅速下降至41%。
2.4 蛋白酶對CBPs溶菌酶活性的影響
蛋白酶對CBPs溶菌酶活性的影響結果見圖4。從圖4A可見，木瓜蛋白酶對2個CBPs溶菌酶組分的酶相對活性的影響差異明顯；隨著作用時間的增加，CBP1溶菌酶組分的酶相對活性出現先上升後下降的趨勢，CBP2溶菌酶組分的酶相對活性變化趨勢為迅速下降至8.7%。胰凝乳蛋白酶對CBPs溶菌酶活性無明顯的作用（所以結果未顯示）。從圖4B可見，胰蛋白酶對CBPs溶菌酶組分的酶相對活性的影響結果是隨著作用時間的增加表現明顯，如作用60 min後CBP1和CBP2溶菌酶組分的酶相對活性均下降至20%左右。
3 討論
溶菌酶是一種鹼性蛋白質，大部分溶菌酶在酸性條件下比較穩定，對熱不穩定，如大麥溶菌酶在pH 4.0、60 ℃以上的環境里急速失活；雞蛋清溶菌酶在pH 3.0時能耐受100 ℃高溫達45 min之久[14，15]。試驗進行的蘿蔔CBPs溶菌酶活性的熱穩定性、酸鹼穩定性研究得到了類似的結果，都是在pH 5.4、65 ℃時迅速失活，而常溫下在pH 3.4～10.6範圍都較穩定。
Meyer[16]研究發現，在酸性條件下用N-溴代琥珀醯亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）、氯化碘（ICl）均可氧化雞蛋清溶菌酶的色氨酸（Tryptophan，Trp），CBPs溶菌酶活性對NaClO（0.003%）也很敏感，專一性化學修飾劑NBS證明Trp是CBP2溶菌酶組分活性中心的必需胺基酸殘基，故有可能是氧化劑NaClO與Trp形成了復合物的緣故。李培峰等[17]在研究H2O2對Cu・Zn-超氧化物歧化酶活力的影響時發現：隨著H2O2濃度的升高及作用時間的增加，Cu・Zn-超氧化物歧化酶的活力下降；進一步的研究發現，還會使組氨酸（Histidine，His）含量減少，天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、谷氨酸（Glutamic acid，Glu）增加。而蘿蔔CBPs對H2O2較敏感，使用專一性化學修飾劑證明Asp/Glu和His可能是溶菌酶活性中心的胺基酸殘基，增加Asp、Glu可能會改變活性中心的構象，或者能減少His對活性的破壞作用[18]。
木瓜蛋白酶是一種多酶混合物，其中的各種酶之間相互協同，故水解蛋白質的能力強。對於CBP1溶菌酶組分而言，可能由於剛加酶液時，活性中心處於木瓜蛋白酶分子達不到的溶菌酶組分分子的內部，此時木瓜蛋白酶並不降解活性中心，反而通過降解其他部位的賴氨酸（Lysine，Lys）、精氨酸（Arginine，Arg）的C-末端，使得分布在各肽段活性中心的構象變成更加適合底物溶壁微球菌的結合降解。隨著時間的推移及構象的變化，會使活性中心暴露，木瓜蛋白酶將活性中心的Glu、Asp降解，破壞了活性中心，故酶活力減弱；而對於CBP2溶菌酶組分來說，可能由於酶活性中心處於易被蛋白酶水解的位置，故加入木瓜蛋白酶後其活性中心馬上被降解，酶活性迅速降低，其對木瓜蛋白酶的敏感程度遠大於CBP1。胰蛋白酶對CBPs溶菌酶活性的影響是隨著作用時間的增加體現出來的，CBP1和CBP2溶菌酶組分的活性對胰蛋白酶均為敏感。
綜上所述，蘿蔔CBPs的穩定性存在差異：CBP2溶菌酶組分對酸及在pH 5.4時對熱較CBP1穩定，對木瓜蛋白酶較CBP1溶菌酶組分敏感；CBP1對氧化劑H2O2、NaClO較CBP2敏感。這種穩定性的差異可能與CBPs胺基酸序列及溶菌酶活性中心的構象差異有關。
參考文獻：
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[17] 李培峰，方允中.過氧化氫對銅鋅超氧化物歧化酶活性及某些理化性質的影響[J].生物化學雜誌，1993，9（4）：411-416.
[18] 賴曉芳，沈善瑞，王煒軍，等.蘿蔔中具溶菌酶活性組分的分子結構分析[J].安徽農業科學，2012，40（27）：13267-13269.
關鍵詞：蘿蔔；溶菌酶活性；幾丁質結合蛋白；穩定性
中圖分類號：S631.1；Q556+.2；Q946.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1330-04
溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）廣泛存在於生物體內，是一類專門作用於微生物細胞壁的水解酶，有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤，增強免疫力等作用，已在醫學、食品、化妝品、生物工程等多個領域得到廣泛應用[1]。對於溶菌酶的發現是從Nicolle 1907年發表枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）溶解因子的報告開始的[1]；而對於溶菌酶本質的研究則是在1922年Fleming等[2]發現人的鼻涕、唾液、眼淚具有較強的溶菌活性、並把起溶菌作用的因子命名為溶菌酶後開始的[3]。在眾多研究中，雞蛋清的溶菌酶（Hen-egg white lysozyme，HEWL）含量多，製備技術較成熟，所以研究較深入[4]。現在植物溶菌酶的研究也取得了很大進展，研究者們已經先後從無花果（Ficus carica L.）[5]、蕪菁（Brassica rapa L.）[6]、莧菜（Amaranthus mangostanus L.）[7]、花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）等植物的組織中及番木瓜（Carica papaya L.）[8]、大牛角瓜[Calotropis gigantea（L.）W. T. Aiton][9]、三葉橡膠樹[Hevea brasiliensis（Willd. ex A. Juss.）Muell. Arg.][10]、冠狀狗牙花[Ervatamia coronaria（Jacq.）Stap f.][11]、敘利亞馬利筋（Asclepias syriaca L.）[12]等植物的乳汁中和蘿蔔（Raphanus sativus L.）[13]塊根組織中提取到了溶菌酶；蘿蔔組織中有2個具有溶菌酶活性的幾丁質結合蛋白（Chitin-binding proteins，CBPs）組分，業界分別表述為CBP1、CBP2；其對進一步了解植物溶菌酶的作用機制和拓展植物溶菌酶的應用範圍具有一定的研究價值。為了弄清楚CBPs的作用機制以及在蘿蔔中的生理功能，試驗探討了CBPs溶菌酶活性在不同環境條件下的穩定性。現將結果報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
蘿蔔取自華南農業大學生命科學學院網室栽培的新鮮蘿蔔塊根；溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）採用美國Sigma公司產品；木瓜蛋白酶液自行配製，由1份木瓜蛋白酶加9份激活劑組成，激活劑含2 mmol/L乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、20 mmol/L半胱氨酸（Cysteine，Cys）；胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）和胰蛋白酶（10 mg/mL）由華南農業大學生命科學學院中心實驗室提供；不同pH的磷酸緩衝液自行配製，H2O2、NaClO等為分析純。
1.2 方法
1.2.1 具溶菌酶活性的CBPs分離及純化 參照文獻[13]的方法，將蘿蔔塊根洗凈、搗碎、離心、取上清，脫氨、再生、幾丁質凝膠親和層析、羧甲基纖維素層析柱離子交換層析，結果從蘿蔔塊根中分離到2個具溶菌酶活性的酶組分CBP1和CBP2，分別將兩者冷凍乾燥，得到粉末狀物質，可視為試驗所需的酶粉。
1.2.2 CBPs溶菌酶活性測定 取2個酶組分的酶粉，在25 ℃環境下，用pH 5.4、50 mmol/L的磷酸緩衝液溶解，配成2個酶組分的酶液，待用。參照文獻[13]的方法。用pH 6.2、50 mmol/L 磷酸緩衝液配製溶壁微球菌懸浮液，在30 ℃條件下取2.5 mL上述懸浮液於比色杯中，分別加入0.1 mL的2個酶組分酶液，迅速攪勻，以每分鐘在450 nm處使吸光度值下降0.001所需的酶量為一個酶活力單位（U）。
1.2.3 CBPs溶菌酶活性的酸鹼穩定性 取2個酶組分的酶粉，用不同pH的50 mmol/L磷酸緩衝液（pH 2.2～10.6、25 ℃）溶解，放置30 min，分別測定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個酶組分之間的酶相對活性。
1.2.4 CBPs溶菌酶活性的熱穩定性 2個酶組分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸緩衝液溶解，在不同溫度（0～80 ℃）下放置30 min，流水冷卻，分別測定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個酶組分之間的酶相對活性。
1.2.5 CBPs溶菌酶活性在氧化劑H2O2、NaClO中的穩定性 2個酶組分的酶粉用pH 5.4的50 mmol/L磷酸緩衝液溶解，分別加入不同終濃度的H2O2（分別配製成5、10、15、20、25 mmol/L梯度溶液）或NaClO（分別配製成5、10、15、20、25、30、35 μg/mL梯度溶液），25 ℃放置30 min，再分別測定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性，比較2個酶組分之間的酶相對活性。
1.2.6 CBPs溶菌酶活性對蛋白酶的穩定性 分別在1 mL 2個酶組分酶液中加入1 mL木瓜蛋白酶液，37 ℃水浴10 min後分別測定CBP1、CBP2組分的溶菌酶活性；分別在1 mL 2個酶組分酶液中加入胰凝乳蛋白酶（100 μg/mL）或胰蛋白酶（10 mg/mL），經30 min後分別測定CBP1、CBP2組分在一定時間範圍（60 min）內的溶菌酶活性，比較2個酶組分之間的酶相對活性。
2 結果與分析
2.1 CBPs溶菌酶活性的酸鹼穩定性
CBPs溶菌酶活性的酸鹼穩定性測定結果見圖1。從圖1可見，在pH 2.2～pH 3.4時，CBP2溶菌酶組分的相對活性升幅小，而CBP1溶菌酶組分的相對活性升幅大；在pH 3.4～pH 10.6時，2個CBPs溶菌酶組分的相對活性都比較穩定；但在pH>10.6時，2個CBPs溶菌酶組分的相對活性迅速降低。
2.2 CBPs溶菌酶活性的熱穩定性
CBPs溶菌酶活性的熱穩定性測定結果見圖2。從圖2可見，在pH 5.4、0～55 ℃範圍內，CBPs溶菌酶活性對溫度不太敏感；60 ℃時，CBP1溶菌酶組分的酶相對活性迅速降低，CBP2溶菌酶組分仍殘餘75%的酶相對活性。繼續升高溫度到65 ℃，則2個CBPs溶菌酶組分的酶相對活性都急劇下降至0。
2.3 氧化劑對CBPs溶菌酶活性的影響
氧化劑對CBPs溶菌酶活性的影響結果見圖3。從圖3A可見，2個CBPs溶菌酶組分的酶相對活性對NaClO都很敏感，尤其是CBP1溶菌酶組分。從圖3B可見，H2O2對2個CBPs溶菌酶組分的酶相對活性影響呈現明顯的差異：其中CBP1溶菌酶組分的酶相對活性在H2O2中不穩定；CBP2溶菌酶組分的酶相對活性在低濃度的H2O2中穩定，當H2O2濃度升高至24 mmol/L時，則酶相對活性迅速下降至41%。
2.4 蛋白酶對CBPs溶菌酶活性的影響
蛋白酶對CBPs溶菌酶活性的影響結果見圖4。從圖4A可見，木瓜蛋白酶對2個CBPs溶菌酶組分的酶相對活性的影響差異明顯；隨著作用時間的增加，CBP1溶菌酶組分的酶相對活性出現先上升後下降的趨勢，CBP2溶菌酶組分的酶相對活性變化趨勢為迅速下降至8.7%。胰凝乳蛋白酶對CBPs溶菌酶活性無明顯的作用（所以結果未顯示）。從圖4B可見，胰蛋白酶對CBPs溶菌酶組分的酶相對活性的影響結果是隨著作用時間的增加表現明顯，如作用60 min後CBP1和CBP2溶菌酶組分的酶相對活性均下降至20%左右。
3 討論
溶菌酶是一種鹼性蛋白質，大部分溶菌酶在酸性條件下比較穩定，對熱不穩定，如大麥溶菌酶在pH 4.0、60 ℃以上的環境里急速失活；雞蛋清溶菌酶在pH 3.0時能耐受100 ℃高溫達45 min之久[14，15]。試驗進行的蘿蔔CBPs溶菌酶活性的熱穩定性、酸鹼穩定性研究得到了類似的結果，都是在pH 5.4、65 ℃時迅速失活，而常溫下在pH 3.4～10.6範圍都較穩定。
Meyer[16]研究發現，在酸性條件下用N-溴代琥珀醯亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）、氯化碘（ICl）均可氧化雞蛋清溶菌酶的色氨酸（Tryptophan，Trp），CBPs溶菌酶活性對NaClO（0.003%）也很敏感，專一性化學修飾劑NBS證明Trp是CBP2溶菌酶組分活性中心的必需胺基酸殘基，故有可能是氧化劑NaClO與Trp形成了復合物的緣故。李培峰等[17]在研究H2O2對Cu・Zn-超氧化物歧化酶活力的影響時發現：隨著H2O2濃度的升高及作用時間的增加，Cu・Zn-超氧化物歧化酶的活力下降；進一步的研究發現，還會使組氨酸（Histidine，His）含量減少，天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、谷氨酸（Glutamic acid，Glu）增加。而蘿蔔CBPs對H2O2較敏感，使用專一性化學修飾劑證明Asp/Glu和His可能是溶菌酶活性中心的胺基酸殘基，增加Asp、Glu可能會改變活性中心的構象，或者能減少His對活性的破壞作用[18]。
木瓜蛋白酶是一種多酶混合物，其中的各種酶之間相互協同，故水解蛋白質的能力強。對於CBP1溶菌酶組分而言，可能由於剛加酶液時，活性中心處於木瓜蛋白酶分子達不到的溶菌酶組分分子的內部，此時木瓜蛋白酶並不降解活性中心，反而通過降解其他部位的賴氨酸（Lysine，Lys）、精氨酸（Arginine，Arg）的C-末端，使得分布在各肽段活性中心的構象變成更加適合底物溶壁微球菌的結合降解。隨著時間的推移及構象的變化，會使活性中心暴露，木瓜蛋白酶將活性中心的Glu、Asp降解，破壞了活性中心，故酶活力減弱；而對於CBP2溶菌酶組分來說，可能由於酶活性中心處於易被蛋白酶水解的位置，故加入木瓜蛋白酶後其活性中心馬上被降解，酶活性迅速降低，其對木瓜蛋白酶的敏感程度遠大於CBP1。胰蛋白酶對CBPs溶菌酶活性的影響是隨著作用時間的增加體現出來的，CBP1和CBP2溶菌酶組分的活性對胰蛋白酶均為敏感。
綜上所述，蘿蔔CBPs的穩定性存在差異：CBP2溶菌酶組分對酸及在pH 5.4時對熱較CBP1穩定，對木瓜蛋白酶較CBP1溶菌酶組分敏感；CBP1對氧化劑H2O2、NaClO較CBP2敏感。這種穩定性的差異可能與CBPs胺基酸序列及溶菌酶活性中心的構象差異有關。
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[10] MARTIN M N. The latex of Hevea brasiliensis contains high levels of both chitinase and chitinase/lysozyme[J]. Plant Physiol，1991，95：469-476.
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