【摘要】目的 比較吡柔比星（Pirarubicin，THP）和其他化療藥物對胃癌組織溫熱協同的作用，探討化療藥物與溫熱化療的協同作用機制。 方法 利用36個病例的手術切除胃癌組織，建立人胃癌組織體外立體培養作用模型,MTSPMS比色法檢測組織培養物活性以了解化療藥物以及溫熱化療的抑瘤效果。TUNEL螢光檢測原位細胞凋亡,HE染色 研究 評價藥物對胃癌組織在組織形態學上的改變並進行電鏡觀察。結果 DDP、MMC和THP對胃癌組織的殺傷均具有較強的溫熱協同關係（P=0.000）,THP單獨處理和溫熱協同處理均具有較強的抑制作用，和其他3種藥物抑制率比較具有顯著性差異（P<0.05）。THP和溫熱協同處理效果和胃癌病例組織學分級有關（P=0.000），而與年齡、性別、腫瘤大小、臨床分期和術前CEA水平無關（P>0.05）。THP溫熱協同處理凋亡指數和其他3種藥物比較具有顯著性差異（P<0.05）。HE染色表明，THP和溫熱處理後，胃癌組織大部崩解，細胞變性壞死。電鏡 分析 表明經THP和溫熱協同處理後細胞胞膜內陷，胞漿空泡化，並出現染色質濃聚，同時核膜消失。結論 THP對胃癌組織具有良好的溫熱協同效應和腫瘤殺傷效果,具有進一步臨床研究價值。
【關鍵詞】吡柔比星；溫熱效應； 胃癌
Chemotherapy Effects of Pirarubicin in Combination with Hyperthermia on Gastric Cancer Tissues in Vitro
Abstract：Objective Comparison of the effects of pirarubicin (THP) in combination with hyperthermia on gastric cancer tissues in vitro and to discuss the underlying mechanisms.Methods In vitro threedimensional acting models were established with tissue biopsies from 36 patients with pathologically confirmed gastric cancer.Tumor cell viability was measured by MTSPMS assay.TUNEL fluorescence detection in situ apoptosis,HE staining was used to study histomorphology of drug treated gastric tissues.Electron microscope observed cells.Results Synergistic effects were observed after tumor tissues were treated with hyperthermia and three drugs including cisplatin,THP,and mitomycin (P=0.000),while THP exhibited superior cytotoxic effects to other drugs on cancer tissues.Furthermore,histomorphological studies suggested strong killing effects of THP on cancer tissues,including disrupted tissue structure,cellular degradation and necrosis,karyopyknosis and karyolysis,also with loss of cytoplasm.Antitumoral effects of THP were associated with pathological grading(P=0.000),while irrelated to patients' gender,age,tumor size，clinical staging and preoperative CEA levels(P>0.05). The apoptosis index has significant difference compared THP and the other three drugs.After treated by THP,the gastric tissues disaggregation,and electron microscope observed cell membrane invagination,endochylema vacuolization.Nuclear membrane diaappeared.Conclusion Synergistic effects of pirarubicin in combination with hyperthermia were evident; cytotoxicity of pirarubicin was thermally enhanced considerably by mild hyperthermia on gastric cancer tissue.THP may be a potential therapeutic drug for intraperitoneal chemohyperthermia.
Key words：Pirarubicin; Hyperthermia; Gastric Cancer
0 引言
消化道惡性腫瘤是臨床最常見的惡性腫瘤， 目前 手術切除仍是 治療 消化道腫瘤的首選方法，但對進展期胃腸道惡性腫瘤，根治手術後仍有較高的復發率。術中腹腔內溫熱灌注化療(Itraoperative peritoneal hyperthermia chemotherapy,地址HC)直接作用於上述復發和轉移部位，對預防胃腸道惡性腫瘤根治術後復發有一定作用，且副作用小，是近年來國內外研究的熱點之一。然而，對於浸潤腹膜下較深的腫瘤，H地址EC化療後仍有腹膜復發。因此，研究和 應用 穿透性好的藥物，提高藥物穿透能力，增強熱的滲透效應將是今後的研究方向。本研究擬建立胃癌組織小塊三維培養技術，研究吡柔比星（Pirarubicin，THP）對胃癌組織的溫熱協同效應和作用機制。
1材料和方法
1.1胃癌標本2004～2005年本院行根治性胃大部切除或胃全切的胃癌手術標本36例，均經病 理學 明確診斷。其中，男22例，女14例，年齡33～85歲，平均60.7歲。患者臨床分期、病理組織學分類、術前CEA水平和腫瘤直徑資料，見表1。表1 胃癌病例背景資料和THP溫熱抑制率（略）
1.2化療藥物
順鉑(DDP)購自齊魯製藥廠，吡柔比星(THP)由深圳萬樂醫藥有限公司提供，絲裂黴素（MMC）為日本協和發酵產品，氟尿嘧啶注射液（5Fu）為浙江海普製藥公司產品。藥物儲存液根據說明書進行配製,儲存於-20℃冰箱。
1.3試劑和耗材無酚紅RPMI 1640和胎牛血清為Hyclone公司產品；MTS購自Promega公司; 硫酸酚嗪甲酯(Phenazine methosulfate,PMS)、DMSO、新黴素和兩性黴素B均為Sigma公司產品；膠原蛋白海綿為北京益而康生物技術有限公司產品，規格為10×1.5×0.1，海綿使用前剪成0.5cm大小；24孔培養板為Costar產品。
1.4溫熱效應研究根據Hoffman[1]等方法，手術標本剝離表面的脂肪和纖維組織，用PBS清洗其表面的血污和髒物，然後將標本置於含有抗生素的浸泡液（新黴素50μg/ml，兩性黴素5μg/ml）中浸泡15min。再加入1640培養液進行洗滌，用手術刀將標本儘量切割成1mm大小的小塊，3塊組織塊加入膠原海綿上，然後轉移至已預加培養基0.6ml的24孔板孔中，培養箱37℃培養過夜。第二天每孔沿孔壁緩慢加入含有藥物的培養基0.4 ml，每個藥物濃度3個平行孔，於42℃作用1h，然後吸出藥物，培養基洗2次，加入新鮮培養液1ml繼續培養3d。目前THP在溫熱化療方面的應用報道甚少,本研究 參考 其靜脈用藥劑量(40mg/m2),濃度設定為32μg/ml。其他藥物濃度參考 文獻 報道[1]，其中，DDP處理濃度為50μg/ml，MMC濃度為15μg/ml，氟尿嘧啶為350μg/ml。
1.5MTSPMS比色法 MTS的配製
以DPBS配製成2mg/ml，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝。 PMS的配製：以PBS配製成100mmol/L的貯存液，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃避光保存。MTSPMS使用液：在新配製的MTS（2mg/ml）中以20∶1體積比加入PMS混和即用。MTSPMS測定方法：24孔培養板每孔加入100μl的MTSPMS使用液，繼續培養4h後，振蕩10min，每孔取100μl，以490nm的波長測定吸光度值（OD490），取三個平行孔均值。
抑制率(%)＝(加藥孔OD-空白孔OD)/(對照孔OD-空白孔OD) ×100
1.6TUNEL螢光檢測原位細胞凋亡藥物處理後的組織小塊置於恆冷箱冰凍切片機切片架上，待組織塊冷凍變硬後切片，厚度為5～7μm。4％多聚甲醛中4℃固定30min，用0.1% TritonX100冰上穿透5min，PBS洗滌3次，共15min。加入FITC標記的TUNEl反應混合物，37℃濕盒反應90min，然後用PBS洗滌3次，共30min,80%磷酸甘油封片。取非壞死區螢光顯微鏡觀察計數200個以上細胞，作陽性率統計（凋亡指數，AI）。
1.7組織和細胞形態學研究
藥物處理後的組織小塊置於10%中性甲醛中4℃固定48h，經系列乙醇脫水，石蠟包埋後切片。切片經蘇木素和伊紅染色，顯微鏡下觀察溫熱化療前後腫瘤組織形態學變化；用於電鏡分析的標本採用2%戊二醛固定，然後依次經四氧化硪處理和梯度脫水後，包埋並切片鏡檢。
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