馬永飛 劉鍇 張巍
摘 要：本文採用QuE-UPLC/MS/MS法測定豬肉、草魚、牛奶、蜂蜜等動物源性食品中氯黴素、甲碸黴素的殘留量。該方法使用乙腈作為提取溶劑，樣品經攪勻、渦旋、振蕩、離心、凈化處理後上機分析。本方法的優點體現在樣品前處理方法簡易、省時，能夠同時檢測氯黴素和甲碸黴素兩種目標組分，在節省了檢測時間的同時降低了基質效應;氯黴素和甲碸黴素的回收率均可達到85%以上，確保了實驗結果的準確性和重現性;氯黴素和甲碸黴素的檢出限均為0.1μg/kg，優於《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯黴素、甲碸黴素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB/T 20756-2006）的檢測方法。
關鍵詞：氯黴素 甲碸黴素 殘留量 QuE-UPLC/MS/MS
氯黴素又名氯胺苯醇，是一種廣譜抗菌素，可有效抑製革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌等多種病原菌[1]。由於氯黴素具有面世時間早、藥性穩定、價格便宜等優點，曾被廣泛應用於畜禽疾病的控制與治療[2]。但是，食品中殘留的氯黴素會對人體健康造成威脅，如可逆性骨髓抑制、神經系統受損等，故西方已開發國家已將氯黴素列為違禁藥物[3]。我國現行有效標準《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》（農業部第235號公告）中也明確規定，氯黴素在動物源性食品中不得檢出[4]。甲碸黴素是氯黴素的同類物[5]，其抗菌譜和抗菌作用與氯黴素相仿——具有廣譜抗微生物作用，可有效殺滅流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌[6]。作為氯黴素的替代品，甲碸黴素能有效克服氯黴素導致的再生障礙性貧血的副作用[7]，故被廣泛應用於動物源性食品的生產以防治畜禽由流感桿菌、大腸桿菌、沙門菌屬感染導致的呼吸系統、肝膽系統、泌尿系統和消化系統疾病[8]，但甲碸黴素殘留量過高也會對人體健康造成危害。因此，全球各國分別制定了甲碸黴素在肉類食品中的最高殘留限量[9]。我國農業部第235號公告中規定，食品中甲碸黴素的最大殘留限量為50μg/kg。
由於動物源性食品中氯黴素類藥物殘留量超標會影響肉、蛋、奶等食品的安全性，不僅會對人體健康產生危害，還不利於我國養殖業的健康發展，更會對我國農產品的出口造成不利影響[10]。因此，開發一種簡便、高效、安全的氯黴素類獸藥殘留檢測方法已迫在眉睫。本研究利用QuE-UPLC/MS/MS法測定草魚、豬肉、牛奶、蜂蜜等動物源性食品中氯黴素類藥物的殘留量，希望能對相關檢測工作起到借鑑作用。
1 材料和方法
1.1 所需儀器設備和試劑樣品
1.1.1 儀器設備
Waters Xevo TQD三重四極杆液質聯用儀，沃特世公司;ME204T分析天平，梅特勒-托利多集團;EPED-PLUS-E3超純水機，南京易普易達科技發展有限公司;HD-2500多管漩渦混合儀，杭州佑寧儀器有限公司;MV5多通道平行濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。
1.1.2 試劑樣品
市售草魚、豬肉、牛奶、蜂蜜等動物源性食品;色譜純乙腈，氯黴素、甲碸黴素標準品，壇墨質檢;ProElut QuE 2mL Tube固相萃取凈化管、0.22μm ProMax尼龍針頭式濾器，迪馬科技。
1.2 操作方法
1.2.1 提取
1.2.1.1 豬肉、草魚、蜂蜜樣品
依次在15mL離心管中加入5.0g待測樣品、2.0g NaCl，攪拌均勻後加入5.0mL乙腈，在多管漩渦混合儀中渦旋混勻1min。振蕩5min，8000rpm下離心3min，取1mL上清液待凈化。
1.2.1.2 牛奶樣品
在15mL離心管中加入5.0g待測樣品、2.0g NaCl，攪拌均勻後加入2.5mL乙腈，在多管漩渦混合儀中渦旋混勻1min。振蕩5min，8000rpm下離心3min，取1mL上清液待凈化。
1.2.2 凈化
將1mL提取液轉移到ProElut QuE 2mL Tube固相萃取凈化管，渦旋混合30s。10000rpm下離心1min，取上清液500μL於濃縮管中，加水100μL，渦旋混勻，室溫下氮吹至剩餘約100μL溶液，加水定容至500μL，混勻，過0.22μm微孔濾膜，進LC-MS/MS分析。
1.2.3色譜條件
1.2.3.1 UPLC條件
色譜柱C18：100×2.1mm，1.8μm;流速：0.2mL/min;進樣量：5μL;柱溫：35℃;流動相A：10mmol/L乙酸銨，流動相B：乙腈;實驗梯度洗脫程序設置參數如表1。
1.2.3.2 質譜條件
電離模式：ESI;掃描方式：負離子掃描;檢測方式：多反應監測;電噴霧電壓：-4500V;霧化器壓力：50psi;輔助氣氣壓：50psi;氣簾氣壓力：20psi;離子源溫度：500℃。
2 結果與討論
2.1 提取溶劑的選擇
查閱文獻可知，氯黴素類藥物殘留的提取劑有乙腈、乙酸乙酯[11]、水[12]等，本實驗比較了3種不同的提取溶劑對提取效果的影響。實驗數據表明，以乙腈作為提取溶劑時，提取效果優於乙酸乙酯和水，故本實驗選用乙腈作為提取溶劑。
2.2 色譜條件的優化
本研究分別以10mmol/L乙酸銨-乙腈、水-甲醇[13]、水-乙腈[14]為流動相，按照「1.2.3.1」中的梯度洗脫條件進行檢測。由實驗結果可知，以10mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相時對氯黴素、甲碸黴素的分離效果最好，色譜峰尖銳、對稱，響應靈敏度最高。
2.3 標準曲線和檢出限
本實驗目標組分在0.25～50μg/kg的範圍內線性關係良好，回歸方程y=0.0084x+0.0366，相關係數R2=0.9932。採用在空白豬肉樣品中添加目標組分的方法，依據GB/T 27415-2013[15]的規定計算得出本實驗最低定量限在0.25μg/kg，檢測限為0.1μg/kg。
2.4 精密度和回收率試驗
分別向空白草魚、豬肉、牛奶、蜂蜜等樣品中添加2個濃度水平的氯黴素、甲碸黴素標準溶液，進行回收率實驗，結果見表2。氯黴素、甲碸黴素的回收率分別為85.8%～96.4%，87.3%～97.1%，相對標準偏差為0.8%～1.3%。
3 結論
本文建立了一種動物源性食品中氯黴素類藥物殘留量的測定方法，即採用乙腈作為提取溶劑，樣品經攪勻、渦旋、振蕩、離心、凈化處理，然後上機分析。本方法的優點為，樣品前處理方法簡易、省時，並且能夠同時檢測氯黴素和甲碸黴素兩種目標組分，在節省檢測時間的同時降低了基質效應;氯黴素和甲碸黴素的回收率均達到85%以上，確保了實驗結果的準確性和重現性;氯黴素和甲碸黴素的檢出限均為0.1μg/kg，優於國家標準GB/T 20756-2006的檢測方法。
參考文獻：
[1] 趙文亞.水產品中氯黴素殘留分析技術的研究[D].南京農業大學，2003.
[2] 蔡夢迪，蔡波，鄭添裕.食品中殘留氯黴素的檢測方法研究[J].科技風，2015（12）：142-143.
[3] 戴華，王美玲，李擁軍，等.飼料中氯黴素、甲碸黴素和氟甲碸黴素含量的HPLC測定方法[J].光譜實驗室，2006（06）：82-86.
[4] 農業部畜牧獸醫局.農業部發布動物性食品中獸藥最高殘留限量[J].中國獸藥雜誌，2003，25（2）：5-11.
[5] 陳月虎.對甲碸基苯甲醛衍生物的合成、結構分析與抗菌活性研究[D].山東理工大學，2012.
[6] 何俊莎，毛以智，王興群.甲碸黴素的抗菌作用和毒、副作用[J].養殖與飼料，2010（4）：47-49.
[7] 韓飛，張曼，張周，等.甲碸黴素臨床應用及殘留檢測的研究進展[J].陝西農業科學，2014，60（7）：55-58.
[8] 陸廣富，陳曉蘭，卜仕金.雞組織中甲碸黴素殘留HPLC檢測方法[J].中國獸醫雜誌，2008（2）.
[9] 馬素英.動物性食品中氯黴素和甲碸黴素殘留的定量及確證方法建立[D].華中農業大學，2005.
[10] 陳一資，胡濱.動物性食品中獸藥殘留的危害及其原因分析[J].食品與生物技術學報， 2009（02）：24-28.
[11] 解秋菊，許靜，王秀娟.水產品中氯黴素的殘留狀況[J].食品研究與開發，2012（01）：150-152.
[12] 於國勝.肉類中氯黴素（CAP）的高效液相色譜測定法[J].分析測試通報，1991（04）：78-79.
[13] 陸桂萍，曲斌.固相萃取-UPLC-MS/MS測定雞肉中的氯黴素殘留[C].中國畜牧獸醫學會動物藥品學分會第四屆全國會員代表大會暨2011學術年會論文集.2011.
[14] 羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，等.QuEChERS/液相色譜-串聯質譜法同時測定魚肉中30種激素類及氯黴素類藥物殘留[J].分析測試學報，2011，30（12）：1329-1337.
[15] GB/T 27415-2013《分析方法檢出限和定量限的評估》[S].
摘 要：本文採用QuE-UPLC/MS/MS法測定豬肉、草魚、牛奶、蜂蜜等動物源性食品中氯黴素、甲碸黴素的殘留量。該方法使用乙腈作為提取溶劑，樣品經攪勻、渦旋、振蕩、離心、凈化處理後上機分析。本方法的優點體現在樣品前處理方法簡易、省時，能夠同時檢測氯黴素和甲碸黴素兩種目標組分，在節省了檢測時間的同時降低了基質效應;氯黴素和甲碸黴素的回收率均可達到85%以上，確保了實驗結果的準確性和重現性;氯黴素和甲碸黴素的檢出限均為0.1μg/kg，優於《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯黴素、甲碸黴素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB/T 20756-2006）的檢測方法。
關鍵詞：氯黴素 甲碸黴素 殘留量 QuE-UPLC/MS/MS
氯黴素又名氯胺苯醇，是一種廣譜抗菌素，可有效抑製革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌等多種病原菌[1]。由於氯黴素具有面世時間早、藥性穩定、價格便宜等優點，曾被廣泛應用於畜禽疾病的控制與治療[2]。但是，食品中殘留的氯黴素會對人體健康造成威脅，如可逆性骨髓抑制、神經系統受損等，故西方已開發國家已將氯黴素列為違禁藥物[3]。我國現行有效標準《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》（農業部第235號公告）中也明確規定，氯黴素在動物源性食品中不得檢出[4]。甲碸黴素是氯黴素的同類物[5]，其抗菌譜和抗菌作用與氯黴素相仿——具有廣譜抗微生物作用，可有效殺滅流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌[6]。作為氯黴素的替代品，甲碸黴素能有效克服氯黴素導致的再生障礙性貧血的副作用[7]，故被廣泛應用於動物源性食品的生產以防治畜禽由流感桿菌、大腸桿菌、沙門菌屬感染導致的呼吸系統、肝膽系統、泌尿系統和消化系統疾病[8]，但甲碸黴素殘留量過高也會對人體健康造成危害。因此，全球各國分別制定了甲碸黴素在肉類食品中的最高殘留限量[9]。我國農業部第235號公告中規定，食品中甲碸黴素的最大殘留限量為50μg/kg。
由於動物源性食品中氯黴素類藥物殘留量超標會影響肉、蛋、奶等食品的安全性，不僅會對人體健康產生危害，還不利於我國養殖業的健康發展，更會對我國農產品的出口造成不利影響[10]。因此，開發一種簡便、高效、安全的氯黴素類獸藥殘留檢測方法已迫在眉睫。本研究利用QuE-UPLC/MS/MS法測定草魚、豬肉、牛奶、蜂蜜等動物源性食品中氯黴素類藥物的殘留量，希望能對相關檢測工作起到借鑑作用。
1 材料和方法
1.1 所需儀器設備和試劑樣品
1.1.1 儀器設備
Waters Xevo TQD三重四極杆液質聯用儀，沃特世公司;ME204T分析天平，梅特勒-托利多集團;EPED-PLUS-E3超純水機，南京易普易達科技發展有限公司;HD-2500多管漩渦混合儀，杭州佑寧儀器有限公司;MV5多通道平行濃縮儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。
1.1.2 試劑樣品
市售草魚、豬肉、牛奶、蜂蜜等動物源性食品;色譜純乙腈，氯黴素、甲碸黴素標準品，壇墨質檢;ProElut QuE 2mL Tube固相萃取凈化管、0.22μm ProMax尼龍針頭式濾器，迪馬科技。
1.2 操作方法
1.2.1 提取
1.2.1.1 豬肉、草魚、蜂蜜樣品
依次在15mL離心管中加入5.0g待測樣品、2.0g NaCl，攪拌均勻後加入5.0mL乙腈，在多管漩渦混合儀中渦旋混勻1min。振蕩5min，8000rpm下離心3min，取1mL上清液待凈化。
1.2.1.2 牛奶樣品
在15mL離心管中加入5.0g待測樣品、2.0g NaCl，攪拌均勻後加入2.5mL乙腈，在多管漩渦混合儀中渦旋混勻1min。振蕩5min，8000rpm下離心3min，取1mL上清液待凈化。
1.2.2 凈化
將1mL提取液轉移到ProElut QuE 2mL Tube固相萃取凈化管，渦旋混合30s。10000rpm下離心1min，取上清液500μL於濃縮管中，加水100μL，渦旋混勻，室溫下氮吹至剩餘約100μL溶液，加水定容至500μL，混勻，過0.22μm微孔濾膜，進LC-MS/MS分析。
1.2.3色譜條件
1.2.3.1 UPLC條件
色譜柱C18：100×2.1mm，1.8μm;流速：0.2mL/min;進樣量：5μL;柱溫：35℃;流動相A：10mmol/L乙酸銨，流動相B：乙腈;實驗梯度洗脫程序設置參數如表1。
1.2.3.2 質譜條件
電離模式：ESI;掃描方式：負離子掃描;檢測方式：多反應監測;電噴霧電壓：-4500V;霧化器壓力：50psi;輔助氣氣壓：50psi;氣簾氣壓力：20psi;離子源溫度：500℃。
2 結果與討論
2.1 提取溶劑的選擇
查閱文獻可知，氯黴素類藥物殘留的提取劑有乙腈、乙酸乙酯[11]、水[12]等，本實驗比較了3種不同的提取溶劑對提取效果的影響。實驗數據表明，以乙腈作為提取溶劑時，提取效果優於乙酸乙酯和水，故本實驗選用乙腈作為提取溶劑。
2.2 色譜條件的優化
本研究分別以10mmol/L乙酸銨-乙腈、水-甲醇[13]、水-乙腈[14]為流動相，按照「1.2.3.1」中的梯度洗脫條件進行檢測。由實驗結果可知，以10mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相時對氯黴素、甲碸黴素的分離效果最好，色譜峰尖銳、對稱，響應靈敏度最高。
2.3 標準曲線和檢出限
本實驗目標組分在0.25～50μg/kg的範圍內線性關係良好，回歸方程y=0.0084x+0.0366，相關係數R2=0.9932。採用在空白豬肉樣品中添加目標組分的方法，依據GB/T 27415-2013[15]的規定計算得出本實驗最低定量限在0.25μg/kg，檢測限為0.1μg/kg。
2.4 精密度和回收率試驗
分別向空白草魚、豬肉、牛奶、蜂蜜等樣品中添加2個濃度水平的氯黴素、甲碸黴素標準溶液，進行回收率實驗，結果見表2。氯黴素、甲碸黴素的回收率分別為85.8%～96.4%，87.3%～97.1%，相對標準偏差為0.8%～1.3%。
3 結論
本文建立了一種動物源性食品中氯黴素類藥物殘留量的測定方法，即採用乙腈作為提取溶劑，樣品經攪勻、渦旋、振蕩、離心、凈化處理，然後上機分析。本方法的優點為，樣品前處理方法簡易、省時，並且能夠同時檢測氯黴素和甲碸黴素兩種目標組分，在節省檢測時間的同時降低了基質效應;氯黴素和甲碸黴素的回收率均達到85%以上，確保了實驗結果的準確性和重現性;氯黴素和甲碸黴素的檢出限均為0.1μg/kg，優於國家標準GB/T 20756-2006的檢測方法。
參考文獻：
[1] 趙文亞.水產品中氯黴素殘留分析技術的研究[D].南京農業大學，2003.
[2] 蔡夢迪，蔡波，鄭添裕.食品中殘留氯黴素的檢測方法研究[J].科技風，2015（12）：142-143.
[3] 戴華，王美玲，李擁軍，等.飼料中氯黴素、甲碸黴素和氟甲碸黴素含量的HPLC測定方法[J].光譜實驗室，2006（06）：82-86.
[4] 農業部畜牧獸醫局.農業部發布動物性食品中獸藥最高殘留限量[J].中國獸藥雜誌，2003，25（2）：5-11.
[5] 陳月虎.對甲碸基苯甲醛衍生物的合成、結構分析與抗菌活性研究[D].山東理工大學，2012.
[6] 何俊莎，毛以智，王興群.甲碸黴素的抗菌作用和毒、副作用[J].養殖與飼料，2010（4）：47-49.
[7] 韓飛，張曼，張周，等.甲碸黴素臨床應用及殘留檢測的研究進展[J].陝西農業科學，2014，60（7）：55-58.
[8] 陸廣富，陳曉蘭，卜仕金.雞組織中甲碸黴素殘留HPLC檢測方法[J].中國獸醫雜誌，2008（2）.
[9] 馬素英.動物性食品中氯黴素和甲碸黴素殘留的定量及確證方法建立[D].華中農業大學，2005.
[10] 陳一資，胡濱.動物性食品中獸藥殘留的危害及其原因分析[J].食品與生物技術學報， 2009（02）：24-28.
[11] 解秋菊，許靜，王秀娟.水產品中氯黴素的殘留狀況[J].食品研究與開發，2012（01）：150-152.
[12] 於國勝.肉類中氯黴素（CAP）的高效液相色譜測定法[J].分析測試通報，1991（04）：78-79.
[13] 陸桂萍，曲斌.固相萃取-UPLC-MS/MS測定雞肉中的氯黴素殘留[C].中國畜牧獸醫學會動物藥品學分會第四屆全國會員代表大會暨2011學術年會論文集.2011.
[14] 羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，等.QuEChERS/液相色譜-串聯質譜法同時測定魚肉中30種激素類及氯黴素類藥物殘留[J].分析測試學報，2011，30（12）：1329-1337.
[15] GB/T 27415-2013《分析方法檢出限和定量限的評估》[S].
收藏