作者：王建偉，嚴宏，王永強，哈文靜，丁正華，郭勇
【關鍵詞】白內障
Alteration of morphology and enzyme activity in dexamethasoninduced cataract in rat lens
【Abstract】 AIM: To observe the morphological features and enzyme activities in dexamethasoninduced organcultured rat lens and to study the mechanisms of steroid cataract. METHODS: One hundred lenses cultured in vitro were divided into 2 groups: control group (DMEM) and dexamethasoninduced cataract group (DMEM+dexamethason 10 μmol/L). Following incubation, the lenses were evaluated daily using a dissecting microscope. On d 1, 3, 5 and 7, 12 lenses of each group were homogenized and the activities of enzymes (catalase, superoxide dismutase, lactate dehydrogenase) were measured, respectively. Two lenses of each group were made into specimen of transmission electron microscopy for the observation of the ultrastructure on d 7. RESULTS: The lenses of control group exhibited mistlike opacity and those of cataract group had dense nuclear opacity on d 7. On d 3, the activities of catalase, superoxide dismutase and lactate dehydrogenase decreased by 34.51%, 7.78%, 15.73% respectively compared with those on d 1. On d 7, they decreased by 84.54%, 30.17%, 40.93% respectively compared with those on d 1. Under electron microscope, the arrangement of fiber cells in control group was in tidy order and the cell membrane, cell junction and organelle were normal, while in cataract group, the arrangement of fiber cells were in untidy order and the lenses consisted of abnormalappearing cells which exhibited swollen mitochondria, a large amount of vacuoles and expanded extracellular lacunae. CONCLUSION: Lenses have nuclear cataract in dexamethasoninduced organcultured rat lens. Oxidative stress may be involved in the steroidinduced cataract formation.
【Keywords】 glucocorticoid; cataract; catalase; superoxide dismutase; lactate dehydrogenase; transmission electron microscope
【摘要】 目的：觀察地塞米松誘導離體大鼠激素性白內障的形態學和酶活性變化，探討激素性白內障發病機制. 方法 ：大鼠的100隻透明晶狀體隨機分為對照組（DMEM）、地塞米松誘導的白內障組（DMEM＋地塞米松10 μmol/L），體外培養7 d，動態觀察晶狀體混濁情況，1,3,5和7 d分別從各組取12隻晶狀體，測定晶狀體中的過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脫氫酶（LDH）活性，7 d從各組取2隻晶狀體做透射電鏡，觀察晶狀體形態學變化. 結果：7 d對照組晶狀體呈霧狀混濁，白內障組晶狀體出現重度核混濁. 培養3 d，CAT,SOD,LDH活性分別下降約34.51%,7.78%,15.73%. 7 d活性分別比第1日下降約84.54%,30.17%,40.93%. 透射電鏡觀察對照組晶狀體纖維細胞層次整齊，細胞膜、細胞連接、細胞器正常. 白內障組纖維細胞排列不齊，細胞間隙增大，線粒體出現空泡變性. 結論：地塞米松可誘導離體大鼠晶狀體產生核性白內障，氧化應激可能參與激素性白內障的形成.
【關鍵詞】 糖皮質激素；白內障；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶；乳酸脫氫酶；透射 電子 顯微鏡
0引言
白內障是世界首位致盲性眼病，其發生與年齡、近視、糖尿病、長期 應用 糖皮質激素等多種危險因素有關. 自1960年Black等首次報道激素與白內障的關係以來，隨著激素在器官移植、免疫性疾病、和戰傷救治等 治療 過程中的大量應用，激素性白內障越來越引起人們的重視［1］. 大量的流行病學資料證實長期大劑量全身、眼局部及吸入糖皮質激素治療均可引起以晶狀體後囊下混濁為特徵的激素性白內障［2,3］. 而激素性白內障發病的確切機制尚未完全闡明， 目前 主要形成了氧化損傷學說、離子轉運障礙學說、晶狀體代謝紊亂學說、蛋白加和物學說、激素通過受體途徑而發揮作用的受體學說［4］. 我們通過離體大鼠晶狀體的培養，建立激素性白內障的離體模型，動態觀測晶狀體的混濁程度，利用透射電子顯微鏡觀察激素性白內障晶狀體的超微結構改變，測定晶狀體中過氧化氫酶（CAT）,超氧化物歧化酶（SOD）及乳酸脫氫酶（LDH）活性的變化，探討氧化損傷在激素性白內障中的作用.
1材料和方法
1.1材料
健康清潔級SD大鼠54隻（第四軍醫大學實驗動物中心提供），雌雄不限，鼠齡4 wk，體質量70~90 g. 地塞米松為美國Sigma公司產品，CAT,SOD,LDH測試盒購自南京建成生物工程 研究 所.
1.2方法
1.2.1離體晶狀體培養以頸椎脫臼法處死SD大鼠，取其眼球，剔除肌肉、筋膜等組織，安爾碘浸泡5 min，生理鹽水沖洗3次，將眼球浸於DMEM液中，由後極部剪開鞏膜，取出晶狀體. 儘量去除晶狀體表面的玻璃體. 將晶狀體放入含5×104 u/L青黴素和5×104 u/L鏈黴素的DMEM培養基中，於37℃下，置50 mL/L CO2細胞培養箱中培養8 h後，棄去混濁晶狀體，留取100隻透明晶狀體備用.
1.2.2激素性白內障模型的建立［5］將100隻備用晶狀體按隨機數字大小等分為兩組：正常對照組（A:DMEM），地塞米松誘導的激素性白內障組（B:DMEM+地塞米松10 μmol/L）. 分別放入含培養基的無菌24孔板中，於37℃下，置50 mL/L CO2細胞培養箱中培養，隔日換液. 培養中每日用解剖顯微鏡觀察晶狀體，記錄晶狀體混濁程度. 各組分別於第1,3,5,7日取出12隻晶狀體，稱質量，-70℃冰箱冷凍保存.
1.2.3晶狀體混濁程度的動態觀察利用解剖顯微鏡，每日觀察、記錄晶狀體混濁程度. 參考 Mathur等［6］離體晶狀體混濁的分級方法，將晶狀體混濁程度分為0~5級，0級=透明晶狀體，1級=晶狀體呈霧狀混濁，2級=晶狀體皮質和核之間出現可見分界，3級=輕度晶狀體核混濁，4級=重度晶狀體核混濁，5級=晶狀體完全混濁（Fig 1）.
1.2.4酶活性測定分別於第1,3,5,7日，從各組中取12隻晶狀體，按50 g/L (W/V)的量加入冷生理鹽水，用勻漿機HEidolph DIAX900粉碎，3000 r/min離心15 min，取上清測定CAT, SOD和LDH活性，實驗中嚴格按測試盒說明的實驗步驟操作.
1.2.5電鏡檢查各取兩組培養7 d的晶狀體2隻，放入40 g/L戊二醛固定液中固定24 h，用磷酸鹽緩衝液沖洗，以10 g/L鋨酸固定1 h，乙醇丙酮系列梯度脫水，環氧樹脂812包埋、聚合，LKB型超薄切片機切片，鉛鈾雙重染色，透射電子顯微鏡JEM100SX下觀察超微結構.
統計學處理：使用SPSS 12.0統計軟體，對等級資料採用Wilcoxon秩和檢驗，定量資料採用析因設計方差 分析 進行不同時間及組間比較.
2結果
2.1晶狀體混濁情況的動態觀察隨作用時間延長，實驗組大鼠晶狀體的混濁程度逐漸加重. 培養1 d，白內障組顯微鏡下見部分晶狀體呈霧狀混濁， 2 d部分晶狀體皮質和核之間出現可見分界，大多晶狀體呈霧狀混濁， 3 d出現輕度晶狀體核混濁，6 d出現重度晶狀體核混濁，7 d有晶狀體完全混濁. 對照組，晶狀體可保持4 d完全透明，4 d開始有少量晶狀體出現霧狀混濁，6 d少量晶狀體皮質和核之間出現可見分界（Fig 1）.
【關鍵詞】白內障
Alteration of morphology and enzyme activity in dexamethasoninduced cataract in rat lens
【Abstract】 AIM: To observe the morphological features and enzyme activities in dexamethasoninduced organcultured rat lens and to study the mechanisms of steroid cataract. METHODS: One hundred lenses cultured in vitro were divided into 2 groups: control group (DMEM) and dexamethasoninduced cataract group (DMEM+dexamethason 10 μmol/L). Following incubation, the lenses were evaluated daily using a dissecting microscope. On d 1, 3, 5 and 7, 12 lenses of each group were homogenized and the activities of enzymes (catalase, superoxide dismutase, lactate dehydrogenase) were measured, respectively. Two lenses of each group were made into specimen of transmission electron microscopy for the observation of the ultrastructure on d 7. RESULTS: The lenses of control group exhibited mistlike opacity and those of cataract group had dense nuclear opacity on d 7. On d 3, the activities of catalase, superoxide dismutase and lactate dehydrogenase decreased by 34.51%, 7.78%, 15.73% respectively compared with those on d 1. On d 7, they decreased by 84.54%, 30.17%, 40.93% respectively compared with those on d 1. Under electron microscope, the arrangement of fiber cells in control group was in tidy order and the cell membrane, cell junction and organelle were normal, while in cataract group, the arrangement of fiber cells were in untidy order and the lenses consisted of abnormalappearing cells which exhibited swollen mitochondria, a large amount of vacuoles and expanded extracellular lacunae. CONCLUSION: Lenses have nuclear cataract in dexamethasoninduced organcultured rat lens. Oxidative stress may be involved in the steroidinduced cataract formation.
【Keywords】 glucocorticoid; cataract; catalase; superoxide dismutase; lactate dehydrogenase; transmission electron microscope
【摘要】 目的：觀察地塞米松誘導離體大鼠激素性白內障的形態學和酶活性變化，探討激素性白內障發病機制. 方法 ：大鼠的100隻透明晶狀體隨機分為對照組（DMEM）、地塞米松誘導的白內障組（DMEM＋地塞米松10 μmol/L），體外培養7 d，動態觀察晶狀體混濁情況，1,3,5和7 d分別從各組取12隻晶狀體，測定晶狀體中的過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脫氫酶（LDH）活性，7 d從各組取2隻晶狀體做透射電鏡，觀察晶狀體形態學變化. 結果：7 d對照組晶狀體呈霧狀混濁，白內障組晶狀體出現重度核混濁. 培養3 d，CAT,SOD,LDH活性分別下降約34.51%,7.78%,15.73%. 7 d活性分別比第1日下降約84.54%,30.17%,40.93%. 透射電鏡觀察對照組晶狀體纖維細胞層次整齊，細胞膜、細胞連接、細胞器正常. 白內障組纖維細胞排列不齊，細胞間隙增大，線粒體出現空泡變性. 結論：地塞米松可誘導離體大鼠晶狀體產生核性白內障，氧化應激可能參與激素性白內障的形成.
【關鍵詞】 糖皮質激素；白內障；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶；乳酸脫氫酶；透射 電子 顯微鏡
0引言
白內障是世界首位致盲性眼病，其發生與年齡、近視、糖尿病、長期 應用 糖皮質激素等多種危險因素有關. 自1960年Black等首次報道激素與白內障的關係以來，隨著激素在器官移植、免疫性疾病、和戰傷救治等 治療 過程中的大量應用，激素性白內障越來越引起人們的重視［1］. 大量的流行病學資料證實長期大劑量全身、眼局部及吸入糖皮質激素治療均可引起以晶狀體後囊下混濁為特徵的激素性白內障［2,3］. 而激素性白內障發病的確切機制尚未完全闡明， 目前 主要形成了氧化損傷學說、離子轉運障礙學說、晶狀體代謝紊亂學說、蛋白加和物學說、激素通過受體途徑而發揮作用的受體學說［4］. 我們通過離體大鼠晶狀體的培養，建立激素性白內障的離體模型，動態觀測晶狀體的混濁程度，利用透射電子顯微鏡觀察激素性白內障晶狀體的超微結構改變，測定晶狀體中過氧化氫酶（CAT）,超氧化物歧化酶（SOD）及乳酸脫氫酶（LDH）活性的變化，探討氧化損傷在激素性白內障中的作用.
1材料和方法
1.1材料
健康清潔級SD大鼠54隻（第四軍醫大學實驗動物中心提供），雌雄不限，鼠齡4 wk，體質量70~90 g. 地塞米松為美國Sigma公司產品，CAT,SOD,LDH測試盒購自南京建成生物工程 研究 所.
1.2方法
1.2.1離體晶狀體培養以頸椎脫臼法處死SD大鼠，取其眼球，剔除肌肉、筋膜等組織，安爾碘浸泡5 min，生理鹽水沖洗3次，將眼球浸於DMEM液中，由後極部剪開鞏膜，取出晶狀體. 儘量去除晶狀體表面的玻璃體. 將晶狀體放入含5×104 u/L青黴素和5×104 u/L鏈黴素的DMEM培養基中，於37℃下，置50 mL/L CO2細胞培養箱中培養8 h後，棄去混濁晶狀體，留取100隻透明晶狀體備用.
1.2.2激素性白內障模型的建立［5］將100隻備用晶狀體按隨機數字大小等分為兩組：正常對照組（A:DMEM），地塞米松誘導的激素性白內障組（B:DMEM+地塞米松10 μmol/L）. 分別放入含培養基的無菌24孔板中，於37℃下，置50 mL/L CO2細胞培養箱中培養，隔日換液. 培養中每日用解剖顯微鏡觀察晶狀體，記錄晶狀體混濁程度. 各組分別於第1,3,5,7日取出12隻晶狀體，稱質量，-70℃冰箱冷凍保存.
1.2.3晶狀體混濁程度的動態觀察利用解剖顯微鏡，每日觀察、記錄晶狀體混濁程度. 參考 Mathur等［6］離體晶狀體混濁的分級方法，將晶狀體混濁程度分為0~5級，0級=透明晶狀體，1級=晶狀體呈霧狀混濁，2級=晶狀體皮質和核之間出現可見分界，3級=輕度晶狀體核混濁，4級=重度晶狀體核混濁，5級=晶狀體完全混濁（Fig 1）.
1.2.4酶活性測定分別於第1,3,5,7日，從各組中取12隻晶狀體，按50 g/L (W/V)的量加入冷生理鹽水，用勻漿機HEidolph DIAX900粉碎，3000 r/min離心15 min，取上清測定CAT, SOD和LDH活性，實驗中嚴格按測試盒說明的實驗步驟操作.
1.2.5電鏡檢查各取兩組培養7 d的晶狀體2隻，放入40 g/L戊二醛固定液中固定24 h，用磷酸鹽緩衝液沖洗，以10 g/L鋨酸固定1 h，乙醇丙酮系列梯度脫水，環氧樹脂812包埋、聚合，LKB型超薄切片機切片，鉛鈾雙重染色，透射電子顯微鏡JEM100SX下觀察超微結構.
統計學處理：使用SPSS 12.0統計軟體，對等級資料採用Wilcoxon秩和檢驗，定量資料採用析因設計方差 分析 進行不同時間及組間比較.
2結果
2.1晶狀體混濁情況的動態觀察隨作用時間延長，實驗組大鼠晶狀體的混濁程度逐漸加重. 培養1 d，白內障組顯微鏡下見部分晶狀體呈霧狀混濁， 2 d部分晶狀體皮質和核之間出現可見分界，大多晶狀體呈霧狀混濁， 3 d出現輕度晶狀體核混濁，6 d出現重度晶狀體核混濁，7 d有晶狀體完全混濁. 對照組，晶狀體可保持4 d完全透明，4 d開始有少量晶狀體出現霧狀混濁，6 d少量晶狀體皮質和核之間出現可見分界（Fig 1）.