張俠陵 熊國祚
南華大學第二附屬醫院，湖南衡陽 421000
[摘要] 下肢深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis of lower extremity，DVT)作為血管外科的常見疾病，其動物模型的建立是研究疾病的發病機制和治療方法的重要條件。該文對近年來對於各種實驗性深靜脈血栓動物模型的方法及其利弊進行概述，為今後動物實驗提供充足的參考依據。
關鍵詞 深靜脈血栓形成；動物模型；DVT
[中圖分類號] R725 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-074２（２０１5）02（c）－０197-02
隨著醫療水平的進步，深靜脈血栓形成因其高發病率、高致死率逐漸受到臨床醫生的重視。目前對其病因的研究仍處於假設階段。動物模型為研究DVT的發病機制和評價對應的治療方法提供了可能，迄今用於深靜脈血栓動物模型約有50年的歷史，現將各主流方法報道如下。
1 下腔靜脈結紮法
1.1 大鼠模型
此為最經典的模型,1980年Reyers等[1]通過結紮大鼠下腔靜脈第一次建立起深靜脈血栓動物模型：將大鼠麻醉後，沿腹白線進腹，分離出下腔靜脈，於左腎靜脈下方結紮其下腔靜脈，縫合後2~6 h打開腹腔，可見血栓形成。此方法結紮後3 h約60%~80%的小鼠可形成血栓，6 h後血栓形成率可達100%。在對於藥物在體內抑制血栓形成的研究中，此法有廣泛的應用。
也有學者在Reyers的方法的基礎上做出許多改進，如張智輝等同時結紮下腔靜脈和髂總靜脈，建立的大鼠深靜脈血栓模型,證明白細胞在DVT形成中起重要作用。並將各種改良法進行比較，證實採用縮窄下腔靜脈+阻斷夾阻斷+結紮腎靜脈至髂靜脈水平的下腔靜脈各屬支的方法，可以建立起穩定的大鼠DVT疾病模型[2]。賽力克·馬高維亞等[3]在備制大鼠深靜脈血栓模型時，將普通交換導絲放置於左腎靜脈與下腔靜脈匯合處下方，與下腔靜脈一併結紮，1 h後抽出導絲。成功建立出，近心端保持通暢的深靜脈血栓動物模型，此法有利於觀察藥物溶栓或抗栓塞作用的效果。
1.2 兔模型
可能因為經濟適用性等原因，以兔下腔靜脈結紮製備深靜脈血栓模型者遠小於大鼠。方法如大鼠模型，在左腎靜脈下方結紮下腔靜脈。兔模型下腔靜脈較粗大，可用於靜脈造影等介入實驗。
2 股靜脈阻斷法
Rhodes等[4]通過暫時阻斷股靜脈近、遠兩端的方法建立了深靜脈血栓犬模型。方法如下：將犬麻醉後，分離出股靜脈，分別結紮股靜脈近、遠兩端約48 h。模型成功率可達97%~100%。此方法還可用於兔模型中，因避免開腹可減少動物創傷，提高實驗動物存活。
造模原理為局部血液瘀滯，內皮細胞損傷，啟動內源性凝血系統，同時異物留置血液中啟動外源性凝血系統，促使血栓形成。Knight 等[5]在麻醉動物後（犬、兔）沿股靜脈走形，切開暴露股靜脈，阻斷股靜脈兩端後，於近心端插入螺旋銅絲，逐層縫合後，建立起深靜脈血栓動物模型。此法結合放射性核素標記法，在研究新、舊血栓成分上有廣泛的應用。
3 股靜脈電刺激法
方法如下：先給大鼠每日肌肉注射地塞米松磷酸鈉，使血液保持高凝狀態。再將大鼠麻醉，經股內側行縱行切口，分離出長約1.5 cm的股靜脈，股靜脈的遠、近端分別接通正、負極電源，1.5 mA,持續7 min。即可形成血栓。楊軍[6]應用此法根據形成的血栓的濕重與纖溶指標，研究藥物對於血栓形成的抗凝作用。此法可在保持血管完整性同時形成血栓，對後續切片觀察提供了便利。
4 凝血酶直接注入法
韓力群等[7]將實驗犬麻醉後，切開暴露右側股靜脈，穿刺置入導管，緩慢注入500U凝血酶。並用彩色超聲都卜勒動態觀察血栓形成過程，成功製備深靜脈血栓動物模型。也可將目標血管暫時阻斷後，注入凝血酶。通過阻斷血流、損傷血管壁、激活凝血因子提高模型製備的成功率。
5 創傷法
創傷性深靜脈血栓動物模型，是具有骨科特點，符合骨科臨床實際的新型動物模型。趙學凌[8]利用自製的打擊裝置，以不同的打擊強度，打擊大鼠雙側大腿近端外側，製作出骨折組（瞬間打擊能量為4.2 J）,創傷組（瞬間打擊能量為2.4 J），兩種大鼠模型。然後均行髖人字石膏固定，成功建立大鼠創傷性深靜脈血栓模型，實驗證明骨折組在第7 d靜脈血栓形成率為85%，為研究創傷性深靜脈血栓形成的理論基礎提供了實驗依據。宋恩等[9]將大鼠股靜脈分離，並用血管鉗夾閉股靜脈約3 s，再用雙後肢髖人字石膏外固定予以制動，最終建立起創傷性深靜脈血栓動物模型。
6 家兔耳緣靜脈血栓法
將家兔耳緣靜脈分離出2 cm長的靜脈段,結紮上下兩端,並暫時阻斷兩側分支血管以阻止血流。抽出該段血液,並注入凝血酶。暫時打開兩側分支血管,使血液充盈入目標靜脈段中，再次阻斷分支血管，使目標靜脈段內形成血塊。取下阻斷分支血管的血管夾,分別打開結紮線,通過透射光觀察血栓消失及血流恢復的時間,此法可以觀察藥物的溶栓作用。
7 展望
研究DVT發病機制、病理變化和治療方法需要合適的動物模型。迄今，建立深靜脈血栓動物模型，主要為阻斷靜脈血流，造成血液淤滯，激活內源性凝血系統，誘發血栓形成。也有許多以注入血栓誘導劑（如凝血酶），加以機械性損傷血管內皮細胞。其中下腔靜脈結紮法最為方便易行且經濟常用，其大鼠血栓模型，普遍用於藥物的抗血栓的機制的研究;對血管介入溶栓、取栓等治療及對血栓影像學診斷的研究,需要較為粗大的犬、兔的股靜脈，其缺點在於實驗費用高昂、造模後管理難度大等方面。侯旭等[10]，通過比較正常動物和老齡動物的深靜脈血栓動物模型中下腔靜脈的拉伸力學特性，表明不同年齡層的動物靜脈血栓形成的條件有所差別。國外學者Mosesson MW[11]，利用轉基因技術，製備的含人體纖維蛋白酶原基因的轉基因老鼠，製作出深靜脈血栓模型，證實了凝血酶-γ鏈序列在血栓形成中有著重要作用。使用轉基因老鼠製備DVT動物模型，有助於對深靜脈血栓形成的發病機制進行更深入的研究，可能成為今後的主流研究方向。目前公認DVT的發病機制是Virchow 的三大病因，即血流滯緩、血液高凝、靜脈壁的損傷。從病因水平製作出DVT 模型，將是製作出符合臨床實際的模型的關鍵，對於今後推進深靜脈血栓形成防治研究有極大的幫助，同時大量文獻證明中醫藥對於深靜脈的發病、發展有良好的干預效果，因此製備出符合中醫證候的深靜脈血栓模型，也將是需要我們努力研究的放向。
參考文獻
[1] Reyers I,Mussoni L ,Donati MB ,et al.Failure of apsirin at different doses to modify experimental thrombosis in rats[J].Thromb Res ,1980，18（5）：669-674.
[2] 張智輝，單臻，王文見，等.下腔靜脈不同處理方法建立大鼠深靜脈血栓形成動物模型的比較[J].中華實驗外科雜誌，2012，29(9):1840-1842.
[3] 賽力克·馬高維亞，王護國，羅軍，等.一種適合動態研究的大鼠深靜脈血栓動物模型[J].中國普外基礎與臨床雜誌，2008，15（6）：408-411.
[4] Rhodes JM,Cho JS. Thrombolysis for experimental deep venous thrombosis maintain valvular competence and vasoreactivity[J].J Vase Surg ,2000，31（6）：1193-1205.
[5] Knight LC ,Maurer Ah ,Ammar IA ,et al . Tc - 99m antifibrin fragment for imaging venous thromb j:Evaluation in a canine model [J ] . Radiology ,1989，173（1）：163-169.
[6] 楊軍,屈立志,楊霄,等. 通塞脈片對深靜脈血栓形成纖溶功能的實驗觀察[J].中藥新藥與臨床藥理,2003（1）：32-33
[7] 韓力群，楊斌，塗宏鋼，等.彩色都卜勒超聲可持續動態觀察的犬急性下肢深靜脈血栓動物模型的構建[J].中華醫學超聲雜誌(電子版)，2011，8（12）：2472-2479.
[8] 趙學凌，吳雪梅，王兵，等.大鼠創傷性肢體深靜脈血栓形成新型動物模型的建立[J].昆明醫學院學報，2005，26(1):4-8.
[9] 宋恩，李雲建，章玉冰，等.Changes of arginase Ⅰ expression in rat deep vein thrombosis modelsJournal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineening Researrh,2011(7):1155-1158.
[10] 侯旭暉，楊松柏，尹健，等.老齡深靜脈血栓動物模型下腔靜脈的力學特性[J].生物醫學工程研究，2012（1）：78-30.
[11] Mosesson MW，Cooley BC，Hernandez I，et al. Thrombosis risk modification in transgenic mice containing the human fibrinogen thrombin － binding gamma＇ chain sequence[J].J Thromb Haemost，2009，7（1）：102-110.
（收稿日期：2014-11-18）
南華大學第二附屬醫院，湖南衡陽 421000
[摘要] 下肢深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis of lower extremity，DVT)作為血管外科的常見疾病，其動物模型的建立是研究疾病的發病機制和治療方法的重要條件。該文對近年來對於各種實驗性深靜脈血栓動物模型的方法及其利弊進行概述，為今後動物實驗提供充足的參考依據。
關鍵詞 深靜脈血栓形成；動物模型；DVT
[中圖分類號] R725 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-074２（２０１5）02（c）－０197-02
隨著醫療水平的進步，深靜脈血栓形成因其高發病率、高致死率逐漸受到臨床醫生的重視。目前對其病因的研究仍處於假設階段。動物模型為研究DVT的發病機制和評價對應的治療方法提供了可能，迄今用於深靜脈血栓動物模型約有50年的歷史，現將各主流方法報道如下。
1 下腔靜脈結紮法
1.1 大鼠模型
此為最經典的模型,1980年Reyers等[1]通過結紮大鼠下腔靜脈第一次建立起深靜脈血栓動物模型：將大鼠麻醉後，沿腹白線進腹，分離出下腔靜脈，於左腎靜脈下方結紮其下腔靜脈，縫合後2~6 h打開腹腔，可見血栓形成。此方法結紮後3 h約60%~80%的小鼠可形成血栓，6 h後血栓形成率可達100%。在對於藥物在體內抑制血栓形成的研究中，此法有廣泛的應用。
也有學者在Reyers的方法的基礎上做出許多改進，如張智輝等同時結紮下腔靜脈和髂總靜脈，建立的大鼠深靜脈血栓模型,證明白細胞在DVT形成中起重要作用。並將各種改良法進行比較，證實採用縮窄下腔靜脈+阻斷夾阻斷+結紮腎靜脈至髂靜脈水平的下腔靜脈各屬支的方法，可以建立起穩定的大鼠DVT疾病模型[2]。賽力克·馬高維亞等[3]在備制大鼠深靜脈血栓模型時，將普通交換導絲放置於左腎靜脈與下腔靜脈匯合處下方，與下腔靜脈一併結紮，1 h後抽出導絲。成功建立出，近心端保持通暢的深靜脈血栓動物模型，此法有利於觀察藥物溶栓或抗栓塞作用的效果。
1.2 兔模型
可能因為經濟適用性等原因，以兔下腔靜脈結紮製備深靜脈血栓模型者遠小於大鼠。方法如大鼠模型，在左腎靜脈下方結紮下腔靜脈。兔模型下腔靜脈較粗大，可用於靜脈造影等介入實驗。
2 股靜脈阻斷法
Rhodes等[4]通過暫時阻斷股靜脈近、遠兩端的方法建立了深靜脈血栓犬模型。方法如下：將犬麻醉後，分離出股靜脈，分別結紮股靜脈近、遠兩端約48 h。模型成功率可達97%~100%。此方法還可用於兔模型中，因避免開腹可減少動物創傷，提高實驗動物存活。
造模原理為局部血液瘀滯，內皮細胞損傷，啟動內源性凝血系統，同時異物留置血液中啟動外源性凝血系統，促使血栓形成。Knight 等[5]在麻醉動物後（犬、兔）沿股靜脈走形，切開暴露股靜脈，阻斷股靜脈兩端後，於近心端插入螺旋銅絲，逐層縫合後，建立起深靜脈血栓動物模型。此法結合放射性核素標記法，在研究新、舊血栓成分上有廣泛的應用。
3 股靜脈電刺激法
方法如下：先給大鼠每日肌肉注射地塞米松磷酸鈉，使血液保持高凝狀態。再將大鼠麻醉，經股內側行縱行切口，分離出長約1.5 cm的股靜脈，股靜脈的遠、近端分別接通正、負極電源，1.5 mA,持續7 min。即可形成血栓。楊軍[6]應用此法根據形成的血栓的濕重與纖溶指標，研究藥物對於血栓形成的抗凝作用。此法可在保持血管完整性同時形成血栓，對後續切片觀察提供了便利。
4 凝血酶直接注入法
韓力群等[7]將實驗犬麻醉後，切開暴露右側股靜脈，穿刺置入導管，緩慢注入500U凝血酶。並用彩色超聲都卜勒動態觀察血栓形成過程，成功製備深靜脈血栓動物模型。也可將目標血管暫時阻斷後，注入凝血酶。通過阻斷血流、損傷血管壁、激活凝血因子提高模型製備的成功率。
5 創傷法
創傷性深靜脈血栓動物模型，是具有骨科特點，符合骨科臨床實際的新型動物模型。趙學凌[8]利用自製的打擊裝置，以不同的打擊強度，打擊大鼠雙側大腿近端外側，製作出骨折組（瞬間打擊能量為4.2 J）,創傷組（瞬間打擊能量為2.4 J），兩種大鼠模型。然後均行髖人字石膏固定，成功建立大鼠創傷性深靜脈血栓模型，實驗證明骨折組在第7 d靜脈血栓形成率為85%，為研究創傷性深靜脈血栓形成的理論基礎提供了實驗依據。宋恩等[9]將大鼠股靜脈分離，並用血管鉗夾閉股靜脈約3 s，再用雙後肢髖人字石膏外固定予以制動，最終建立起創傷性深靜脈血栓動物模型。
6 家兔耳緣靜脈血栓法
將家兔耳緣靜脈分離出2 cm長的靜脈段,結紮上下兩端,並暫時阻斷兩側分支血管以阻止血流。抽出該段血液,並注入凝血酶。暫時打開兩側分支血管,使血液充盈入目標靜脈段中，再次阻斷分支血管，使目標靜脈段內形成血塊。取下阻斷分支血管的血管夾,分別打開結紮線,通過透射光觀察血栓消失及血流恢復的時間,此法可以觀察藥物的溶栓作用。
7 展望
研究DVT發病機制、病理變化和治療方法需要合適的動物模型。迄今，建立深靜脈血栓動物模型，主要為阻斷靜脈血流，造成血液淤滯，激活內源性凝血系統，誘發血栓形成。也有許多以注入血栓誘導劑（如凝血酶），加以機械性損傷血管內皮細胞。其中下腔靜脈結紮法最為方便易行且經濟常用，其大鼠血栓模型，普遍用於藥物的抗血栓的機制的研究;對血管介入溶栓、取栓等治療及對血栓影像學診斷的研究,需要較為粗大的犬、兔的股靜脈，其缺點在於實驗費用高昂、造模後管理難度大等方面。侯旭等[10]，通過比較正常動物和老齡動物的深靜脈血栓動物模型中下腔靜脈的拉伸力學特性，表明不同年齡層的動物靜脈血栓形成的條件有所差別。國外學者Mosesson MW[11]，利用轉基因技術，製備的含人體纖維蛋白酶原基因的轉基因老鼠，製作出深靜脈血栓模型，證實了凝血酶-γ鏈序列在血栓形成中有著重要作用。使用轉基因老鼠製備DVT動物模型，有助於對深靜脈血栓形成的發病機制進行更深入的研究，可能成為今後的主流研究方向。目前公認DVT的發病機制是Virchow 的三大病因，即血流滯緩、血液高凝、靜脈壁的損傷。從病因水平製作出DVT 模型，將是製作出符合臨床實際的模型的關鍵，對於今後推進深靜脈血栓形成防治研究有極大的幫助，同時大量文獻證明中醫藥對於深靜脈的發病、發展有良好的干預效果，因此製備出符合中醫證候的深靜脈血栓模型，也將是需要我們努力研究的放向。
參考文獻
[1] Reyers I,Mussoni L ,Donati MB ,et al.Failure of apsirin at different doses to modify experimental thrombosis in rats[J].Thromb Res ,1980，18（5）：669-674.
[2] 張智輝，單臻，王文見，等.下腔靜脈不同處理方法建立大鼠深靜脈血栓形成動物模型的比較[J].中華實驗外科雜誌，2012，29(9):1840-1842.
[3] 賽力克·馬高維亞，王護國，羅軍，等.一種適合動態研究的大鼠深靜脈血栓動物模型[J].中國普外基礎與臨床雜誌，2008，15（6）：408-411.
[4] Rhodes JM,Cho JS. Thrombolysis for experimental deep venous thrombosis maintain valvular competence and vasoreactivity[J].J Vase Surg ,2000，31（6）：1193-1205.
[5] Knight LC ,Maurer Ah ,Ammar IA ,et al . Tc - 99m antifibrin fragment for imaging venous thromb j:Evaluation in a canine model [J ] . Radiology ,1989，173（1）：163-169.
[6] 楊軍,屈立志,楊霄,等. 通塞脈片對深靜脈血栓形成纖溶功能的實驗觀察[J].中藥新藥與臨床藥理,2003（1）：32-33
[7] 韓力群，楊斌，塗宏鋼，等.彩色都卜勒超聲可持續動態觀察的犬急性下肢深靜脈血栓動物模型的構建[J].中華醫學超聲雜誌(電子版)，2011，8（12）：2472-2479.
[8] 趙學凌，吳雪梅，王兵，等.大鼠創傷性肢體深靜脈血栓形成新型動物模型的建立[J].昆明醫學院學報，2005，26(1):4-8.
[9] 宋恩，李雲建，章玉冰，等.Changes of arginase Ⅰ expression in rat deep vein thrombosis modelsJournal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineening Researrh,2011(7):1155-1158.
[10] 侯旭暉，楊松柏，尹健，等.老齡深靜脈血栓動物模型下腔靜脈的力學特性[J].生物醫學工程研究，2012（1）：78-30.
[11] Mosesson MW，Cooley BC，Hernandez I，et al. Thrombosis risk modification in transgenic mice containing the human fibrinogen thrombin － binding gamma＇ chain sequence[J].J Thromb Haemost，2009，7（1）：102-110.
（收稿日期：2014-11-18）
收藏