【摘要】 目的 考察國產琥乙紅黴素原料和製劑的組分和有關物質，為修訂中國藥典2005年版琥乙紅黴素質量標準提供依據。方法 採用美國藥典30版收載的HPLC法測定6個廠家的紅黴素原料、琥乙紅黴素原料和製劑共16批樣品的組分和有關物質，並採用歐洲藥典5.0版收載的方法測定琥乙紅黴素樣品中游離紅黴素的含量。結果 國產紅黴素以紅黴素A為主組分，含有少量的紅黴素B、紅黴素C和紅黴素E組分，有關物質主要為脫水紅黴素A，其它有關物質含量較少。以紅黴素為原料合成的琥乙紅黴素中的主要有關物質為游離紅黴素。結論 建議將中國藥典2005版琥乙紅黴素有關物質的薄層色譜法修訂為高效液相色譜法，便於更好地控制產品質量。
【關鍵詞】 琥乙紅黴素； HPLC； 組分和有關物質； 游離紅黴素
ABSTRACT Objective To investigate the related substances profiles of the domestic erythromycin ethylsuccinate bulk material and preparation, and provide data for the monograph of erythromycin ethylsuccinate in the Chinese PharmacopoEia 2005. Method The ingredient and the related substances of totally 16 batches of erythromycin ethylsuccinate bulk material and preparation of 6 manufacturers were determined using the HPLC method of USP 30, and the erythromycin free base were determined using the method of EP 5.0. Results The major ingredient of domestic erythromycin was erythromycin A and there were minor amount of erythromycin B, C and E. The main related substances was anhydroerythromycin A and the content of other impurities were relatively small. The major related substances of erythromycin ethylsuccinate synthesized by using erythromycin as starting material was erythromycin free base. Conclusion To ensure better quality control for the products, it is recommended that the TLC method involved in the Chinese Pharmacopoeia 2005 to determine the related substances of erythromycin ethylsuccinate to be replaced by the HPLC method.
KEY WORDS Erythromycin ethylsuccinate; HPLC; Related substances; Erythromycin free base
琥乙紅黴素是以紅黴素為原料合成的琥珀酸乙酯衍生物，其組分和有關物質與紅黴素原料中的組分和有關物質及廠家的生產工藝密切相關。琥乙紅黴素質量標準在中國藥典2005版［1］、美國藥典30版［2］和歐洲藥典5.0版［3］均有收載，中國藥典2005版系採用薄層色譜法測定有關物質，對琥乙紅黴素各組分及有關物質的定性和定量結果均比較差。USP30版和歐洲藥典5.0版則採用HPLC法進行定量測定。USP30版採用雜質對照品對已知雜質進行定量，控制紅黴素A烯醇醚不得超過3.0%，N去甲基紅黴素A不得超過3.0%，任意單個雜質不得超過3.0%；歐洲藥典則採用相對保留時間確定各組分及已知雜質，控制任意單個雜質不得超過3.0%，總雜質不得超過5.0%，並對合成工藝和貯藏條件下產生的游離紅黴素進行了限度要求。目前國內對琥乙紅黴素有關物質的研究較多［4～6］，但大多僅限於對單個游離紅黴素的測定或有關物質總量的測定，對琥乙紅黴素組分及各有關物質未作系統研究。本文參考USP30版和歐洲藥典5.0版的標準，對國內6個廠家的琥乙紅黴素原料及其製劑的組分和有關物質及游離紅黴素進行了定性和定量測定，為了解國內琥乙紅黴素產品質量和修訂中國藥典2005版標準提供依據。
1 儀器與試藥
液相色譜儀採用Shimadzu高效液相色譜儀(LC20AT泵、SPDM20A檢測器、SIL20AC自動進樣系統)，Shimadzu LC Solution色譜工作站。
紅黴素對照品(LOT 24200M)、紅黴素B對照品(LOT G1C080)、紅黴素C對照品(LOT 24202F3)、N去甲基紅黴素A對照品(LOT 24202F2)購自美國藥典委員會，叔丁醇、乙腈、甲醇為色譜純，水為雙蒸水。
2 實驗方法
2.1 溶液的製備
(1)有關物質測定
對照品溶液① 取50mg紅黴素對照品，精密稱定，置25ml容量瓶中，加甲醇12.5ml，振搖使溶解，用水解液［磷酸氫二鉀(2到100)，用磷酸調pH為8.0］稀釋至刻度，搖勻。
對照品溶液② 分別取紅黴素B對照品和紅黴素C對照品各5mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加甲醇25ml，振搖使溶解，加對照品溶液①2.5ml，用水解液稀釋至刻度，搖勻。
系統適用性溶液 取2mg N去甲基紅黴素A對照品，加至20ml對照品溶液②，混勻。
紅黴素A烯醇醚溶液 取紅黴素USP對照品10mg，加甲醇2ml溶解，加pH3.5磷酸鹽緩衝液20ml，放置30min後使用。
供試品溶液① 精密稱取紅黴素約100mg，置50ml容量瓶中，加甲醇至刻度。
供試品溶液② 精密稱取琥乙紅黴素約115mg(製劑按標示量計算取相當量細粉)，置50ml容量瓶中，加甲醇25ml，振搖使溶解，加水解液20ml，混勻，在室溫放置12h使水解，用水解液稀釋至刻度，立即進樣。
(2)游離紅黴素測定
對照品溶液 取紅黴素對照品(中國藥品生物製品檢定所，130307200215，紅黴素A92.3%，紅黴素B0.9%，紅黴素C1.2%)約16mg，至50ml容量瓶中，加流動相至刻度(立即使用)。
樣品溶液的製備 稱取琥乙紅黴素約125mg(製劑按標示量計算取相當量細粉)，置25ml容量瓶中，用流動相溶解並稀釋至刻度，立即進樣。
2.2 試驗條件
(1)有關物質 色譜柱為Polymer Laboratories 1000A(250mm×4.6mm，8μm)，S/N：8MRPS10436A38；流動相為pH8.0緩衝液50ml，加400ml水，加175ml叔丁醇和30ml乙腈，用水稀釋至1000ml，混勻；檢測波長215nm；柱溫70℃；流速1.0ml/min，進樣50μl。
(2)游離紅黴素 色譜柱為phenomenex Dose: Gemin C18 110A(250mm×4.6mm， 5μm)；流動相為含2.0g/L的乙腈∶3.4g/L磷酸二氫鉀(35∶65)溶液，用磷酸調pH3.0；檢測波長195nm；柱溫為室溫；進樣量20μl。
3 結果及討論
3.1 琥乙紅黴素有關物質峰的歸屬
通過對照品可以確定紅黴素A、紅黴素B、紅黴素C、N去甲基紅黴素A和紅黴素A烯醇醚，並參考歐洲藥典以相對於紅黴素A保留時間確定了水解物(RRT小於0.3)、N琥珀酸乙酯紅黴素(RRT 1.3)、脫水紅黴素A(RRT 1.4)和假紅黴素A烯醇醚(RRT 1.5)，琥乙紅黴素有關物質的典型色譜圖見圖1。
3.2 產品有關物質分析結果
(1)原料 表1結果顯示，國產紅黴素以紅黴素A為主組分，紅黴素B和紅黴素C的含量較少，與國外紅黴素組分不同，國外藥典將紅黴素B和紅黴素C組分作為活性組分，對其限度較寬，規定紅黴素B組分不得超過12%、紅黴素C組分不得超過5%。企業②產品中紅黴素B含量略高於企業①產品，其脫水紅黴素A雜質也相對較高，紅黴素E組分兩個原料廠家均有，說明不同廠家、不同批次產品，由於菌種不同、發酵工藝和培養條件變化，產品中各組分的含量也不同。企業①琥乙紅黴素中脫水紅黴素A較其原料紅黴素略有增加，提示合成工藝中會引入脫水紅黴素A雜質。
(2)製劑 表2是琥乙紅黴素製劑有關物質測定結果。琥乙紅黴素製劑中的有關物質主要為脫水紅黴素A、紅黴素A烯醇醚和未知雜質(RRT 0.77)，各企業產品的有關物質含量不同，企業⑤產品中脫水紅黴素A和假紅黴素A烯醇醚的含量較高，使有關物質總量(除紅黴素B和紅黴素C組分外各有關物質之和)較高。企業①琥乙紅黴素製劑與琥乙紅黴素原料中的脫水紅黴素A含量相當，提示製劑工藝中不再產生脫水紅黴素A。
3.3 產品中游離紅黴素的測定結果
測定游離紅黴素要求在琥乙紅黴素未水解成紅黴素的條件下進行測定，故歐洲藥典5.0版採用兩種色譜系統測定琥乙紅黴素有關物質，一是採用聚合柱，將琥乙紅黴素水解成紅黴素後測定其組分和有關物質，二是採用C18柱系統將琥乙紅黴素樣品溶解後直接測定游離紅黴素。國內文獻［5］報道的測定游離紅黴素方法中紅黴素峰旁有1個較難分開的未知成分峰，影響游離紅黴素的準確定量。而歐洲藥典5.0版收載的方法分離效果好(圖2)。表3顯示採用歐洲藥典5.0版方法測定琥乙紅黴素製劑中游離紅黴素的結果，企業①產品原料的游離紅黴素含量小於膠囊和片劑，由於游離紅黴素易在高溫和高濕下產生，提示生產企業在表2 琥乙紅黴素製劑有關物質測定結果典型色譜圖生產工藝和儲存條件上應加以控制。15批樣品中企業④的游離紅黴素含量超過限度，提示在藥品標準中控制游離紅黴素含量的必要性。
4 小結
國產紅黴素由於菌種和發酵工藝與國外產品不同，最後產品以紅黴素A為主組分，含有少量的紅黴素B、紅黴素C和紅黴素E組分，有關物質主要為脫水紅黴素A，其它有關物質含量較少。以紅黴素為原料合成的琥乙紅黴素由於生產廠家和工藝不同，所含各組分的量也不同， 通過對各有關物質的定性和定量分
表3 琥乙紅黴素中游離紅黴素的測定結果
劑 型企業和批次游離紅黴素(%)原料①10.62原料①20.61原料①30.49膠囊①42.63膠囊①52.18膠囊①61.93片劑①72.02片劑①82.25片劑①92.56原料②13.65原料②23.36片劑③ 1.67片劑④ 6.59片劑⑤ 4.22顆粒⑥ 2.40
析，可以判定產品的優劣。同時對產品中游離紅黴素的考察，也可以發現不同企業間產品的差異。建議進一步提高中國藥典2005版琥乙紅黴素質量標準，以更好地控制產品質量。
【參考文獻】
［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2005年版(二部)［S］. 北京：化學工業出版社，2005：677.
［2］ USP(美國藥典)［S］. 30版. 2007，2：2067.
［3］ EP(歐洲藥典)［S］. 5.0版. 2004：1521.
［4］ 余建清，雷嘉川，羅順德，等. 離子抑制色譜法測定琥乙紅黴素含量及其有關物質［J］. 中國藥物科學雜誌，2003，12(1)：41～44.
［5］ 佟志，鍾長鳴，王慶全. HPLC法測定琥乙紅黴素口服製劑中紅黴素殘留量［J］. 藥品評價，2005，2(6)：434～435.
［6］ 陶濤，劉浩. 琥乙紅黴素咀嚼片有關物質的檢查［J］. 中國藥品標準，2002，3(3)：52～55.
【關鍵詞】 琥乙紅黴素； HPLC； 組分和有關物質； 游離紅黴素
ABSTRACT Objective To investigate the related substances profiles of the domestic erythromycin ethylsuccinate bulk material and preparation, and provide data for the monograph of erythromycin ethylsuccinate in the Chinese PharmacopoEia 2005. Method The ingredient and the related substances of totally 16 batches of erythromycin ethylsuccinate bulk material and preparation of 6 manufacturers were determined using the HPLC method of USP 30, and the erythromycin free base were determined using the method of EP 5.0. Results The major ingredient of domestic erythromycin was erythromycin A and there were minor amount of erythromycin B, C and E. The main related substances was anhydroerythromycin A and the content of other impurities were relatively small. The major related substances of erythromycin ethylsuccinate synthesized by using erythromycin as starting material was erythromycin free base. Conclusion To ensure better quality control for the products, it is recommended that the TLC method involved in the Chinese Pharmacopoeia 2005 to determine the related substances of erythromycin ethylsuccinate to be replaced by the HPLC method.
KEY WORDS Erythromycin ethylsuccinate; HPLC; Related substances; Erythromycin free base
琥乙紅黴素是以紅黴素為原料合成的琥珀酸乙酯衍生物，其組分和有關物質與紅黴素原料中的組分和有關物質及廠家的生產工藝密切相關。琥乙紅黴素質量標準在中國藥典2005版［1］、美國藥典30版［2］和歐洲藥典5.0版［3］均有收載，中國藥典2005版系採用薄層色譜法測定有關物質，對琥乙紅黴素各組分及有關物質的定性和定量結果均比較差。USP30版和歐洲藥典5.0版則採用HPLC法進行定量測定。USP30版採用雜質對照品對已知雜質進行定量，控制紅黴素A烯醇醚不得超過3.0%，N去甲基紅黴素A不得超過3.0%，任意單個雜質不得超過3.0%；歐洲藥典則採用相對保留時間確定各組分及已知雜質，控制任意單個雜質不得超過3.0%，總雜質不得超過5.0%，並對合成工藝和貯藏條件下產生的游離紅黴素進行了限度要求。目前國內對琥乙紅黴素有關物質的研究較多［4～6］，但大多僅限於對單個游離紅黴素的測定或有關物質總量的測定，對琥乙紅黴素組分及各有關物質未作系統研究。本文參考USP30版和歐洲藥典5.0版的標準，對國內6個廠家的琥乙紅黴素原料及其製劑的組分和有關物質及游離紅黴素進行了定性和定量測定，為了解國內琥乙紅黴素產品質量和修訂中國藥典2005版標準提供依據。
1 儀器與試藥
液相色譜儀採用Shimadzu高效液相色譜儀(LC20AT泵、SPDM20A檢測器、SIL20AC自動進樣系統)，Shimadzu LC Solution色譜工作站。
紅黴素對照品(LOT 24200M)、紅黴素B對照品(LOT G1C080)、紅黴素C對照品(LOT 24202F3)、N去甲基紅黴素A對照品(LOT 24202F2)購自美國藥典委員會，叔丁醇、乙腈、甲醇為色譜純，水為雙蒸水。
2 實驗方法
2.1 溶液的製備
(1)有關物質測定
對照品溶液① 取50mg紅黴素對照品，精密稱定，置25ml容量瓶中，加甲醇12.5ml，振搖使溶解，用水解液［磷酸氫二鉀(2到100)，用磷酸調pH為8.0］稀釋至刻度，搖勻。
對照品溶液② 分別取紅黴素B對照品和紅黴素C對照品各5mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加甲醇25ml，振搖使溶解，加對照品溶液①2.5ml，用水解液稀釋至刻度，搖勻。
系統適用性溶液 取2mg N去甲基紅黴素A對照品，加至20ml對照品溶液②，混勻。
紅黴素A烯醇醚溶液 取紅黴素USP對照品10mg，加甲醇2ml溶解，加pH3.5磷酸鹽緩衝液20ml，放置30min後使用。
供試品溶液① 精密稱取紅黴素約100mg，置50ml容量瓶中，加甲醇至刻度。
供試品溶液② 精密稱取琥乙紅黴素約115mg(製劑按標示量計算取相當量細粉)，置50ml容量瓶中，加甲醇25ml，振搖使溶解，加水解液20ml，混勻，在室溫放置12h使水解，用水解液稀釋至刻度，立即進樣。
(2)游離紅黴素測定
對照品溶液 取紅黴素對照品(中國藥品生物製品檢定所，130307200215，紅黴素A92.3%，紅黴素B0.9%，紅黴素C1.2%)約16mg，至50ml容量瓶中，加流動相至刻度(立即使用)。
樣品溶液的製備 稱取琥乙紅黴素約125mg(製劑按標示量計算取相當量細粉)，置25ml容量瓶中，用流動相溶解並稀釋至刻度，立即進樣。
2.2 試驗條件
(1)有關物質 色譜柱為Polymer Laboratories 1000A(250mm×4.6mm，8μm)，S/N：8MRPS10436A38；流動相為pH8.0緩衝液50ml，加400ml水，加175ml叔丁醇和30ml乙腈，用水稀釋至1000ml，混勻；檢測波長215nm；柱溫70℃；流速1.0ml/min，進樣50μl。
(2)游離紅黴素 色譜柱為phenomenex Dose: Gemin C18 110A(250mm×4.6mm， 5μm)；流動相為含2.0g/L的乙腈∶3.4g/L磷酸二氫鉀(35∶65)溶液，用磷酸調pH3.0；檢測波長195nm；柱溫為室溫；進樣量20μl。
3 結果及討論
3.1 琥乙紅黴素有關物質峰的歸屬
通過對照品可以確定紅黴素A、紅黴素B、紅黴素C、N去甲基紅黴素A和紅黴素A烯醇醚，並參考歐洲藥典以相對於紅黴素A保留時間確定了水解物(RRT小於0.3)、N琥珀酸乙酯紅黴素(RRT 1.3)、脫水紅黴素A(RRT 1.4)和假紅黴素A烯醇醚(RRT 1.5)，琥乙紅黴素有關物質的典型色譜圖見圖1。
3.2 產品有關物質分析結果
(1)原料 表1結果顯示，國產紅黴素以紅黴素A為主組分，紅黴素B和紅黴素C的含量較少，與國外紅黴素組分不同，國外藥典將紅黴素B和紅黴素C組分作為活性組分，對其限度較寬，規定紅黴素B組分不得超過12%、紅黴素C組分不得超過5%。企業②產品中紅黴素B含量略高於企業①產品，其脫水紅黴素A雜質也相對較高，紅黴素E組分兩個原料廠家均有，說明不同廠家、不同批次產品，由於菌種不同、發酵工藝和培養條件變化，產品中各組分的含量也不同。企業①琥乙紅黴素中脫水紅黴素A較其原料紅黴素略有增加，提示合成工藝中會引入脫水紅黴素A雜質。
(2)製劑 表2是琥乙紅黴素製劑有關物質測定結果。琥乙紅黴素製劑中的有關物質主要為脫水紅黴素A、紅黴素A烯醇醚和未知雜質(RRT 0.77)，各企業產品的有關物質含量不同，企業⑤產品中脫水紅黴素A和假紅黴素A烯醇醚的含量較高，使有關物質總量(除紅黴素B和紅黴素C組分外各有關物質之和)較高。企業①琥乙紅黴素製劑與琥乙紅黴素原料中的脫水紅黴素A含量相當，提示製劑工藝中不再產生脫水紅黴素A。
3.3 產品中游離紅黴素的測定結果
測定游離紅黴素要求在琥乙紅黴素未水解成紅黴素的條件下進行測定，故歐洲藥典5.0版採用兩種色譜系統測定琥乙紅黴素有關物質，一是採用聚合柱，將琥乙紅黴素水解成紅黴素後測定其組分和有關物質，二是採用C18柱系統將琥乙紅黴素樣品溶解後直接測定游離紅黴素。國內文獻［5］報道的測定游離紅黴素方法中紅黴素峰旁有1個較難分開的未知成分峰，影響游離紅黴素的準確定量。而歐洲藥典5.0版收載的方法分離效果好(圖2)。表3顯示採用歐洲藥典5.0版方法測定琥乙紅黴素製劑中游離紅黴素的結果，企業①產品原料的游離紅黴素含量小於膠囊和片劑，由於游離紅黴素易在高溫和高濕下產生，提示生產企業在表2 琥乙紅黴素製劑有關物質測定結果典型色譜圖生產工藝和儲存條件上應加以控制。15批樣品中企業④的游離紅黴素含量超過限度，提示在藥品標準中控制游離紅黴素含量的必要性。
4 小結
國產紅黴素由於菌種和發酵工藝與國外產品不同，最後產品以紅黴素A為主組分，含有少量的紅黴素B、紅黴素C和紅黴素E組分，有關物質主要為脫水紅黴素A，其它有關物質含量較少。以紅黴素為原料合成的琥乙紅黴素由於生產廠家和工藝不同，所含各組分的量也不同， 通過對各有關物質的定性和定量分
表3 琥乙紅黴素中游離紅黴素的測定結果
劑 型企業和批次游離紅黴素(%)原料①10.62原料①20.61原料①30.49膠囊①42.63膠囊①52.18膠囊①61.93片劑①72.02片劑①82.25片劑①92.56原料②13.65原料②23.36片劑③ 1.67片劑④ 6.59片劑⑤ 4.22顆粒⑥ 2.40
析，可以判定產品的優劣。同時對產品中游離紅黴素的考察，也可以發現不同企業間產品的差異。建議進一步提高中國藥典2005版琥乙紅黴素質量標準，以更好地控制產品質量。
【參考文獻】
［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2005年版(二部)［S］. 北京：化學工業出版社，2005：677.
［2］ USP(美國藥典)［S］. 30版. 2007，2：2067.
［3］ EP(歐洲藥典)［S］. 5.0版. 2004：1521.
［4］ 余建清，雷嘉川，羅順德，等. 離子抑制色譜法測定琥乙紅黴素含量及其有關物質［J］. 中國藥物科學雜誌，2003，12(1)：41～44.
［5］ 佟志，鍾長鳴，王慶全. HPLC法測定琥乙紅黴素口服製劑中紅黴素殘留量［J］. 藥品評價，2005，2(6)：434～435.
［6］ 陶濤，劉浩. 琥乙紅黴素咀嚼片有關物質的檢查［J］. 中國藥品標準，2002，3(3)：52～55.
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