【摘要】 目的 研究川芎嗪對SGC7901胃腺癌細胞及人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)增殖的影響。方法 將不同濃度川芎嗪分別加入體外培養的胃癌細胞，在無因子培養基和在條件培養基中培養的HUVEC中，用MTT法檢測細胞增殖情況。結果 川芎嗪濃度為25～625 μg/mL時，對SGC7901胃腺癌細胞和無因子基培養的HUVEC增殖均無影響(P＞0.05)；川芎嗪濃度為125 μg/mL作用48、72 h、濃度為625 μg/mL作用24、48、72 h對條件培養基誘導的HUVEC增殖有明顯影響(P＜0.05)，增殖抑制率隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而升高。結論 川芎嗪對胃腺癌細胞和血管內皮細胞無直接殺傷作用，但對條件培養基誘導的HUVEC增殖具有抑制作用。
【關鍵詞】 胃腺癌；血管內皮細胞；川芎嗪；生長抑制劑
胃癌是一種常見的對人類危害較大的疾病，我國在20世紀90年代進行的全國惡性腫瘤死亡率調查表明，胃癌死亡率高居惡性腫瘤死亡率的首位［1］，目前使用手術、化療、放療等 治療 方法存在許多局限，而且不能有效防治胃癌的轉移和復發。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從活血化瘀中藥川芎中分離得到的一種生物鹼，主要應用於缺血性心、腦血管疾病，毒副作用少。有研究發現［2］，川芎嗪對MKN45人胃癌低分化腺癌細胞有直接的殺傷作用；張薇等［3］的研究則顯示川芎嗪能抑制胃癌前病變大鼠新生血管生成，可能對胃癌具有一定的預防和治療作用。本文擬通過MTT比色法觀察川芎嗪對胃癌細胞和血管內皮細胞增殖的影響，初步探討川芎嗪在胃癌治療中的作用和意義。
1 材料與方法
1.1 材料 RMPI 1640培養基(美國Gibco)，SFM培養基(美國Gibco)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，谷氨醯胺(美國Amresco，博理分裝)，重組人β內皮細胞生長因子(rhβECGF,美國R&D)，F8兔抗人多克隆抗體、FITC羊抗兔IgG(武漢博士德)，鹽酸川芎嗪注射液(常州製藥廠有限公司，規格：40 mg/2 mL，批號：0403231)，MTT(美國Amersco，博理分裝)。
1.2 方法
1.2.1 胃癌細胞培養 SGC7901胃腺癌細胞(購自 中國 科學 院上海細胞庫)，用RMPI 1640完全培養基(加入10%胎牛血清、2 mM谷氨醯胺)培養。
1.2.2 HUVEC培養 採用胰蛋白酶消化法分離獲取［45］。用內皮細胞培養基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨醯胺和1 ng/mL rhβECGF的SFM培養基)培養，傳代後用第八因子相關抗原免疫螢光染色法進行鑑定。HUVEC第3～6代用於實驗。
1.2.3 川芎嗪對細胞增殖影響的檢測
1.2.3.1 對胃腺癌細胞增殖的影響 SGC7901胃腺癌細胞以1×104個/mL的密度接種於96孔板內，每孔接種100 μL，用RMPI 1640完全培養基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨醯胺)培養。培養24 h後，吸棄孔中培養基。每塊培養板分4組，每組6個復孔。正常對照組加入100 μL/孔RMPI 1640完全培養基；川芎嗪組則將含川芎嗪25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的RMPI1640培養基依次加入相應的孔中，每孔100 μL。藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況(檢測490 nm處光吸收值)。
1.2.3.2 對無因子培養HUVEC細胞增殖的影響 HUVEC以2×104個/mL的密度接種於96孔板內，每孔接種100 μL，用SFM完全培養基(含10%胎牛血清和2 mM谷氨醯胺)培養。培養24 h後，吸棄孔中培養基。每塊培養板分4組，每組6個復孔。正常對照組則加入100 μL/孔SFM完全培養基；川芎嗪組則將含25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的SFM完全培養基依次加入相應孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況(檢測490 nm處光吸收值)。
1.2.3.3 對胃腺癌細胞條件培養基誘導的HUVEC增殖的影響 胃腺癌細胞接種於75 cm2培養瓶內，每瓶接種以1.5×106個/mL，加入SFM完全培養基至5 mL。培養48 h後，將培養上清吸至同一離心管內，1 500 r/min離心10 min。離心後的上清收集於新的離心管內，-20℃凍存備用。
HUVEC以2×104個/mL的密度接種於96孔板內，每孔接種100 μL，共接種3個培養板，用SFM完全培養基培養。培養24 h後，吸棄孔中培養基。每塊培養板分7組，每組6個復孔。正常對照組加入100 μL/孔的SFM完全培養基；條件對照組加入100 μL/孔的條件培養基(將上述收集的胃腺癌細胞培養上清與SFM完全培養基按1∶1的比例混勻)；川芎嗪組將含川芎嗪終濃度為25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的條件培養基依次加入相應各孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況。
1.3 統計學分析 上述實驗各進行2次，實驗數據用SPSS 13.0統計軟體進行處理,相同時間點均數間兩兩比較使用單因素方差分析，方差齊則用LSDt檢驗，方差不齊用DunnettsC檢驗。
【關鍵詞】 胃腺癌；血管內皮細胞；川芎嗪；生長抑制劑
胃癌是一種常見的對人類危害較大的疾病，我國在20世紀90年代進行的全國惡性腫瘤死亡率調查表明，胃癌死亡率高居惡性腫瘤死亡率的首位［1］，目前使用手術、化療、放療等 治療 方法存在許多局限，而且不能有效防治胃癌的轉移和復發。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從活血化瘀中藥川芎中分離得到的一種生物鹼，主要應用於缺血性心、腦血管疾病，毒副作用少。有研究發現［2］，川芎嗪對MKN45人胃癌低分化腺癌細胞有直接的殺傷作用；張薇等［3］的研究則顯示川芎嗪能抑制胃癌前病變大鼠新生血管生成，可能對胃癌具有一定的預防和治療作用。本文擬通過MTT比色法觀察川芎嗪對胃癌細胞和血管內皮細胞增殖的影響，初步探討川芎嗪在胃癌治療中的作用和意義。
1 材料與方法
1.1 材料 RMPI 1640培養基(美國Gibco)，SFM培養基(美國Gibco)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，谷氨醯胺(美國Amresco，博理分裝)，重組人β內皮細胞生長因子(rhβECGF,美國R&D)，F8兔抗人多克隆抗體、FITC羊抗兔IgG(武漢博士德)，鹽酸川芎嗪注射液(常州製藥廠有限公司，規格：40 mg/2 mL，批號：0403231)，MTT(美國Amersco，博理分裝)。
1.2 方法
1.2.1 胃癌細胞培養 SGC7901胃腺癌細胞(購自 中國 科學 院上海細胞庫)，用RMPI 1640完全培養基(加入10%胎牛血清、2 mM谷氨醯胺)培養。
1.2.2 HUVEC培養 採用胰蛋白酶消化法分離獲取［45］。用內皮細胞培養基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨醯胺和1 ng/mL rhβECGF的SFM培養基)培養，傳代後用第八因子相關抗原免疫螢光染色法進行鑑定。HUVEC第3～6代用於實驗。
1.2.3 川芎嗪對細胞增殖影響的檢測
1.2.3.1 對胃腺癌細胞增殖的影響 SGC7901胃腺癌細胞以1×104個/mL的密度接種於96孔板內，每孔接種100 μL，用RMPI 1640完全培養基(含10%胎牛血清、2 mM谷氨醯胺)培養。培養24 h後，吸棄孔中培養基。每塊培養板分4組，每組6個復孔。正常對照組加入100 μL/孔RMPI 1640完全培養基；川芎嗪組則將含川芎嗪25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的RMPI1640培養基依次加入相應的孔中，每孔100 μL。藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況(檢測490 nm處光吸收值)。
1.2.3.2 對無因子培養HUVEC細胞增殖的影響 HUVEC以2×104個/mL的密度接種於96孔板內，每孔接種100 μL，用SFM完全培養基(含10%胎牛血清和2 mM谷氨醯胺)培養。培養24 h後，吸棄孔中培養基。每塊培養板分4組，每組6個復孔。正常對照組則加入100 μL/孔SFM完全培養基；川芎嗪組則將含25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的SFM完全培養基依次加入相應孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況(檢測490 nm處光吸收值)。
1.2.3.3 對胃腺癌細胞條件培養基誘導的HUVEC增殖的影響 胃腺癌細胞接種於75 cm2培養瓶內，每瓶接種以1.5×106個/mL，加入SFM完全培養基至5 mL。培養48 h後，將培養上清吸至同一離心管內，1 500 r/min離心10 min。離心後的上清收集於新的離心管內，-20℃凍存備用。
HUVEC以2×104個/mL的密度接種於96孔板內，每孔接種100 μL，共接種3個培養板，用SFM完全培養基培養。培養24 h後，吸棄孔中培養基。每塊培養板分7組，每組6個復孔。正常對照組加入100 μL/孔的SFM完全培養基；條件對照組加入100 μL/孔的條件培養基(將上述收集的胃腺癌細胞培養上清與SFM完全培養基按1∶1的比例混勻)；川芎嗪組將含川芎嗪終濃度為25 μg/mL，125 μg/mL，625 μg/mL的條件培養基依次加入相應各孔中，每孔100 μL。分別在藥物作用第24、48、72 h取出一塊培養板，MTT法檢測細胞增殖情況。
1.3 統計學分析 上述實驗各進行2次，實驗數據用SPSS 13.0統計軟體進行處理,相同時間點均數間兩兩比較使用單因素方差分析，方差齊則用LSDt檢驗，方差不齊用DunnettsC檢驗。