馮偉 馮雅琪 徐晶雪
摘 要：乳酸菌是生物體中有益菌的重要組成，篩選出產酸能力強、能夠起到腸道醫生作用且安全性高的乳酸菌，並應用於相關發酵產品生產對生物健康至關重要。該研究通過碳酸鈣-MRS透明圈法從酸菜中篩選乳酸菌，利用對羥基聯苯法測定乳酸菌發酵液中乳酸含量，選取產乳酸超過30mg/mL的菌株4株作為候選菌株，對其進行常見致病菌的抑菌能力和十大類常見抗生素的藥物耐受性的測定。結果表明，備選菌株對常見致病菌均具有一定的抑菌性能，其中2個菌株在抗生素耐藥性方面表現出了較好的安全性。篩選出的2株菌株的產酸性能強，腸道有害菌抑菌效果明顯，安全性高。
關鍵詞：乳酸菌;乳酸;抑菌;耐藥
中圖分類號 TS255.54文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）07-0032-03
Screening of Functional Lactic Acid Bacteria with High Lactic Acid Production in Kimchi
FANG Wei1 et al.
（1Daqing Normal University， Daqing 163712， China）
Abstract： Lactic acid bacteria are an important component of beneficial bacteria in organisms. It is very important for biological health to screen the lactic acid bacteria with strong acid production ability， which can play the role of intestinal doctor and have high safety and apply them to the production of related fermentation products. This experiment through the calcium carbonate-MRS transparent ring method from the screening of lactobacillus in the sour pickled cabbage， using the method of hydroxy diphenyl lactic acid content in the determination of lactic acid bacteria fermented liquid， and choose to produce lactic acid more than 30mg/mL strains 4 strains as candidate strain， on the strains of common pathogenic bacteria of ten kinds of common antibiotics antibacterial ability and the determination of drug tolerance. The results showed that all the candidate strains had certain antibacterial properties against common pathogenic bacteria， and two strains showed good safety in antibiotic resistance. Finally， two strains were obtained， which had strong acid production ability， obvious inhibitory effect on intestinal harmful bacteria and high safety.
Key words： Lactobacillus; Lactate; Antibacterial; Drug resistance
1 引言
隨著經濟的飛速發展，人們更加注重健康養生。乳酸菌是人體腸道有益菌群中的重要組成部分，近年來，隨著人們對乳酸菌功能和作用機理的深入研究，乳酸菌被認為是最具有開發價值的健康菌，越來越受到關注。篩選出品質和性狀更為優異的菌種對於乳酸菌產品的研發尤為重要。
生物腸道有益菌中乳酸菌數量多，可通過菌體自身和產生的代謝物抑制致病菌從而調節腸道菌群平衡。乳酸菌在生物腸道內可以利用其中的營養物質代謝產生大量乳酸，乳酸使腸道酸性環境加強，許多致病菌因不能耐受酸性環境而死亡，也能通過產生酶阻止致病菌及其毒素黏附和侵入腸黏膜上皮細胞。保持腸道內的酸性環境，可促進腸蠕動，防止有害微生物的攻擊，使機體保持健康，也可以增強腸道的免疫能力[1]。
近年來的研究發現，乳酸菌中的耐藥基因可能會通過多種方式轉移給腸道中其他菌種，若轉移到致病菌中，引起有害菌產生耐藥性的危險。因此，根據國家藥典規定益生菌需進行常見抗生素類藥物耐藥性測定，獲得安全性乳酸菌至關重要[2]。
本研究在傳統發酵方法製作的泡菜中通過碳酸鈣法篩選乳酸菌，進一步利用對羥基聯苯法對菌株的產乳酸能力進行測定，選取產乳酸多的菌株作為候選菌株。採用杯碟法和藥敏製片法對候選菌株分別進行抑菌性和耐藥性的測定，以篩選出能夠應用於發酵生產的安全性乳酸菌。
2 研究方法
2.1 試劑的配製 （1）MRS培養基（1000mL）[3]：K2HPO4 2.0g、檸檬酸三銨2.0g、無水乙酸鈉5.0g、MnSO4·7H20 0.25g、MgSO4·7H2O 0.58g、葡萄糖20.0g、蛋白腖10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸膏5.0g、吐溫-80 1mL。
（2）碳酸鈣-MRS培養基：MRS培養基中加瓊脂20.0g在滅菌後加入5%（W/V）滅菌CaCO3粉末搖勻，製備具有CaCO3的MRS培養基。
（3）鎢酸溶液[4]：0.667mol/L硫酸及10%（W/V）鎢酸鈉溶液等體積混合，使用前配製。
（4）20%（W/V）硫酸銅溶液：稱取硫酸銅20g，加蒸餾水定容至100mL。
（5）對羥基聯苯溶液：稱取對羥基聯苯1.5g溶於100mL的0.125mol/L氫氧化鈉溶液中（配製時加熱助溶，溶解後為澄清液體），貯存於棕色瓶中，保存於4℃冰箱。
（6）乳酸標準儲存液（0.5mg/mL）：精確稱取無水乳酸鋰53.25mg，溶於50mL蒸餾水中，加0.5mol/L硫酸10mL，後加蒸餾水定容至100mL，混勻後保存於4℃冰箱。
2.2 乳酸菌篩選 取適量樣品於9mL生理鹽水中，進行適當稀釋後塗布後塗布於碳酸鈣-MRS培養平板中，37℃培養箱中倒置培養48h。將有明顯透明圈單菌落採用平板劃線分離法進行劃線分離，直至得到純菌。對比菌落形態並採用革蘭氏染色進行初步形態鑑定。
2.3 菌株的產乳酸能力測定
2.3.1 標準曲線製作 0.5mg/mL乳酸標準液與發酵液同樣預處理後，取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mL處理液，分別加進預先編號的試管，再用蒸餾水補足體積至5mL，氫氧化鈣0.05g，20%硫酸銅0.8mL，濃硫酸6mL，對羥基聯苯0.125mL，靜置15min，加熱顯色5min。分別測定565nm吸光度[4]。
2.3.2 發酵液中乳酸含量測定 將篩選得到的乳酸菌菌株接種至接種至MRS液體培養基中，重複轉接3次。菌懸液離心，吸取上清液0.5mL置於潔凈離心管中，加入等體積1mol/L硫酸，靜置，10000r/min離心10min，以除去硫酸鈣，取上清液適當稀釋，吸取稀釋液2mL於潔凈離心管中，加入2mL鎢酸溶液，混勻，室溫靜置，直至溶液中出現明顯絮狀物，10000r/min離心10min，取上清液置於10mL潔凈離心管中，60℃水浴保溫30min左右，依據標準曲線中乳酸測定方法進行測定。
2.4 菌株抑菌能力測定 （1）指示菌菌懸液和實驗菌株菌液的製備：將實驗室保藏的大腸桿菌等致病菌作為指示菌，指示菌液體培養基以5%的接種量轉接3代，實驗菌株以1%接種量轉接3次。（2）檢測平板的製作：向培養皿中倒入10mL 2%水瓊脂培養基，冷卻放入牛津杯，將適當稀釋度指示菌液0.5mL與另10mL營養瓊脂混合均勻倒入平板，冷卻即為檢測平板。（3）菌株抑菌能力的測定：將實驗菌菌懸液4000r/min離心5min，取適量上清液加入到檢測平板小孔中，每個樣品做3個對照，待一定時間後觀察乳酸菌培養液對常見致病菌抑菌圈直徑[5]。
2.5 菌株耐藥能力測定 向培養皿中倒入10mL2%水瓊脂，將另10mL滅菌MRS培養基與適量實驗菌株菌懸液混合，倒入平皿。待冷卻把各抗生素藥敏製片貼在平板上。37℃培養48h，測量各抗生素抑菌圈直徑。
3 結果與分析
3.1 乳酸菌的初步篩選與形態鑑定 通過碳酸鈣透明圈法篩選得到10株有透明圈菌株，透明圈直徑差距不大，詳見表1。
選擇產生透明圈的菌株10株進行革蘭氏染色，染色結果均為革蘭氏陽性，結合各菌株菌落形態白色較小不透明的特點，初步判斷均為乳酸菌，詳見表2。
3.2 菌株的產乳酸能力
3.2.1 乳酸標準曲線 經試驗測定乳酸含量的標準曲線為：y=0.117x+0.0122，R2=0.9937
3.2.2 菌株的產乳酸量 採用對羥基聯苯法測定菌株產乳酸量，結果如表3所示。其中，Z2、Z3、Z6和Z7菌株產乳酸能力較高，超過30μg/mL，作為備選菌株。
3.3 菌株的抑菌性能 選擇產乳酸能力高的4株菌進行抑菌試驗，主要觀察其對腸道內常見菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌性能，結果如表4所示。由表4可知，4株菌對於3種常見致病菌都有一定程度的抑菌作用。其中，Z3、Z6號菌株對大腸桿菌的抑制作用較明顯，相比較，Z6號菌株對3種常見致病菌的抑制作用比Z3號菌株強。
3.4 菌株的耐藥性能 主要測定Z2、Z3、Z6、和Z7號菌株對常用八大類抗生素的耐藥性能，通過實驗可知菌株對抗生素類藥的物敏感性，其結果如表5所示。由表5可知，Z2菌株對青黴素類、四環素類、糖肽類具有耐藥性;Z7菌株對青黴素類、大環內酯類、喹諾酮類具有耐藥性，對糖肽類中度耐藥;Z3對四環素類具有耐藥性、糖肽類中度耐藥;Z6僅對糖肽類中度耐藥。綜合比較菌株Z3與Z6的耐藥類型較少，安全性較高。
4 結論
本研究通過碳酸鈣-MRS透明圈法初步篩選得到具有產透明圈能力的菌株10株，通過菌落形態觀察和革蘭氏染色初步判斷各菌株為乳酸菌，進一步測定菌株產乳酸能力，得到4株產乳酸量超過30mg/mL乳酸菌。4株菌對於腸道中常見有害菌均具有一定的抑制性，抑制性與產乳酸量有一定相關性，產酸量較高的Z3和Z6對有害菌的抑制性也較明顯。經抗生素耐藥性試驗表明，Z3和Z6這2株菌表現出了較好的安全性。最終篩選得到2株具有產酸性能強、腸道有害菌抑菌效果明顯且安全性高的菌株，可作為乳酸菌製劑或發酵食品添加劑的備選菌株。
參考文獻
[1]劉小翠，安志鵬，楊瑩，等.小米發酵液中高發酵性能乳酸菌的分離篩選與鑑定[J].食品科技，2020，45（08）：15-19.
[2]孫悅.抗耐藥性埃希氏大腸桿菌乳酸菌的篩選及抑菌機制研究[D].錦州：渤海大學，2020.
[3]袁丹丹，張曉元，郝榮華，等.產抑菌物質乳酸菌的篩選鑑定及生物學特性研究[J].生物技術，2019，29（04）：376-381.
[4]劉樹昕，吳愛娟，甄妮，等.廣譜抑菌乳酸菌的篩選及其細菌素相關基因分析[J].食品科學，2020，41（06）：101-107.
[5]高熳熳，焦新雅，張志勝，等.侗族傳統發酵酸肉中乳酸菌的篩選、發酵特性及安全性分析[J].食品工業科技，2020，41（12）：94-99，105.
（責編：張宏民）
摘 要：乳酸菌是生物體中有益菌的重要組成，篩選出產酸能力強、能夠起到腸道醫生作用且安全性高的乳酸菌，並應用於相關發酵產品生產對生物健康至關重要。該研究通過碳酸鈣-MRS透明圈法從酸菜中篩選乳酸菌，利用對羥基聯苯法測定乳酸菌發酵液中乳酸含量，選取產乳酸超過30mg/mL的菌株4株作為候選菌株，對其進行常見致病菌的抑菌能力和十大類常見抗生素的藥物耐受性的測定。結果表明，備選菌株對常見致病菌均具有一定的抑菌性能，其中2個菌株在抗生素耐藥性方面表現出了較好的安全性。篩選出的2株菌株的產酸性能強，腸道有害菌抑菌效果明顯，安全性高。
關鍵詞：乳酸菌;乳酸;抑菌;耐藥
中圖分類號 TS255.54文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）07-0032-03
Screening of Functional Lactic Acid Bacteria with High Lactic Acid Production in Kimchi
FANG Wei1 et al.
（1Daqing Normal University， Daqing 163712， China）
Abstract： Lactic acid bacteria are an important component of beneficial bacteria in organisms. It is very important for biological health to screen the lactic acid bacteria with strong acid production ability， which can play the role of intestinal doctor and have high safety and apply them to the production of related fermentation products. This experiment through the calcium carbonate-MRS transparent ring method from the screening of lactobacillus in the sour pickled cabbage， using the method of hydroxy diphenyl lactic acid content in the determination of lactic acid bacteria fermented liquid， and choose to produce lactic acid more than 30mg/mL strains 4 strains as candidate strain， on the strains of common pathogenic bacteria of ten kinds of common antibiotics antibacterial ability and the determination of drug tolerance. The results showed that all the candidate strains had certain antibacterial properties against common pathogenic bacteria， and two strains showed good safety in antibiotic resistance. Finally， two strains were obtained， which had strong acid production ability， obvious inhibitory effect on intestinal harmful bacteria and high safety.
Key words： Lactobacillus; Lactate; Antibacterial; Drug resistance
1 引言
隨著經濟的飛速發展，人們更加注重健康養生。乳酸菌是人體腸道有益菌群中的重要組成部分，近年來，隨著人們對乳酸菌功能和作用機理的深入研究，乳酸菌被認為是最具有開發價值的健康菌，越來越受到關注。篩選出品質和性狀更為優異的菌種對於乳酸菌產品的研發尤為重要。
生物腸道有益菌中乳酸菌數量多，可通過菌體自身和產生的代謝物抑制致病菌從而調節腸道菌群平衡。乳酸菌在生物腸道內可以利用其中的營養物質代謝產生大量乳酸，乳酸使腸道酸性環境加強，許多致病菌因不能耐受酸性環境而死亡，也能通過產生酶阻止致病菌及其毒素黏附和侵入腸黏膜上皮細胞。保持腸道內的酸性環境，可促進腸蠕動，防止有害微生物的攻擊，使機體保持健康，也可以增強腸道的免疫能力[1]。
近年來的研究發現，乳酸菌中的耐藥基因可能會通過多種方式轉移給腸道中其他菌種，若轉移到致病菌中，引起有害菌產生耐藥性的危險。因此，根據國家藥典規定益生菌需進行常見抗生素類藥物耐藥性測定，獲得安全性乳酸菌至關重要[2]。
本研究在傳統發酵方法製作的泡菜中通過碳酸鈣法篩選乳酸菌，進一步利用對羥基聯苯法對菌株的產乳酸能力進行測定，選取產乳酸多的菌株作為候選菌株。採用杯碟法和藥敏製片法對候選菌株分別進行抑菌性和耐藥性的測定，以篩選出能夠應用於發酵生產的安全性乳酸菌。
2 研究方法
2.1 試劑的配製 （1）MRS培養基（1000mL）[3]：K2HPO4 2.0g、檸檬酸三銨2.0g、無水乙酸鈉5.0g、MnSO4·7H20 0.25g、MgSO4·7H2O 0.58g、葡萄糖20.0g、蛋白腖10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸膏5.0g、吐溫-80 1mL。
（2）碳酸鈣-MRS培養基：MRS培養基中加瓊脂20.0g在滅菌後加入5%（W/V）滅菌CaCO3粉末搖勻，製備具有CaCO3的MRS培養基。
（3）鎢酸溶液[4]：0.667mol/L硫酸及10%（W/V）鎢酸鈉溶液等體積混合，使用前配製。
（4）20%（W/V）硫酸銅溶液：稱取硫酸銅20g，加蒸餾水定容至100mL。
（5）對羥基聯苯溶液：稱取對羥基聯苯1.5g溶於100mL的0.125mol/L氫氧化鈉溶液中（配製時加熱助溶，溶解後為澄清液體），貯存於棕色瓶中，保存於4℃冰箱。
（6）乳酸標準儲存液（0.5mg/mL）：精確稱取無水乳酸鋰53.25mg，溶於50mL蒸餾水中，加0.5mol/L硫酸10mL，後加蒸餾水定容至100mL，混勻後保存於4℃冰箱。
2.2 乳酸菌篩選 取適量樣品於9mL生理鹽水中，進行適當稀釋後塗布後塗布於碳酸鈣-MRS培養平板中，37℃培養箱中倒置培養48h。將有明顯透明圈單菌落採用平板劃線分離法進行劃線分離，直至得到純菌。對比菌落形態並採用革蘭氏染色進行初步形態鑑定。
2.3 菌株的產乳酸能力測定
2.3.1 標準曲線製作 0.5mg/mL乳酸標準液與發酵液同樣預處理後，取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mL處理液，分別加進預先編號的試管，再用蒸餾水補足體積至5mL，氫氧化鈣0.05g，20%硫酸銅0.8mL，濃硫酸6mL，對羥基聯苯0.125mL，靜置15min，加熱顯色5min。分別測定565nm吸光度[4]。
2.3.2 發酵液中乳酸含量測定 將篩選得到的乳酸菌菌株接種至接種至MRS液體培養基中，重複轉接3次。菌懸液離心，吸取上清液0.5mL置於潔凈離心管中，加入等體積1mol/L硫酸，靜置，10000r/min離心10min，以除去硫酸鈣，取上清液適當稀釋，吸取稀釋液2mL於潔凈離心管中，加入2mL鎢酸溶液，混勻，室溫靜置，直至溶液中出現明顯絮狀物，10000r/min離心10min，取上清液置於10mL潔凈離心管中，60℃水浴保溫30min左右，依據標準曲線中乳酸測定方法進行測定。
2.4 菌株抑菌能力測定 （1）指示菌菌懸液和實驗菌株菌液的製備：將實驗室保藏的大腸桿菌等致病菌作為指示菌，指示菌液體培養基以5%的接種量轉接3代，實驗菌株以1%接種量轉接3次。（2）檢測平板的製作：向培養皿中倒入10mL 2%水瓊脂培養基，冷卻放入牛津杯，將適當稀釋度指示菌液0.5mL與另10mL營養瓊脂混合均勻倒入平板，冷卻即為檢測平板。（3）菌株抑菌能力的測定：將實驗菌菌懸液4000r/min離心5min，取適量上清液加入到檢測平板小孔中，每個樣品做3個對照，待一定時間後觀察乳酸菌培養液對常見致病菌抑菌圈直徑[5]。
2.5 菌株耐藥能力測定 向培養皿中倒入10mL2%水瓊脂，將另10mL滅菌MRS培養基與適量實驗菌株菌懸液混合，倒入平皿。待冷卻把各抗生素藥敏製片貼在平板上。37℃培養48h，測量各抗生素抑菌圈直徑。
3 結果與分析
3.1 乳酸菌的初步篩選與形態鑑定 通過碳酸鈣透明圈法篩選得到10株有透明圈菌株，透明圈直徑差距不大，詳見表1。
選擇產生透明圈的菌株10株進行革蘭氏染色，染色結果均為革蘭氏陽性，結合各菌株菌落形態白色較小不透明的特點，初步判斷均為乳酸菌，詳見表2。
3.2 菌株的產乳酸能力
3.2.1 乳酸標準曲線 經試驗測定乳酸含量的標準曲線為：y=0.117x+0.0122，R2=0.9937
3.2.2 菌株的產乳酸量 採用對羥基聯苯法測定菌株產乳酸量，結果如表3所示。其中，Z2、Z3、Z6和Z7菌株產乳酸能力較高，超過30μg/mL，作為備選菌株。
3.3 菌株的抑菌性能 選擇產乳酸能力高的4株菌進行抑菌試驗，主要觀察其對腸道內常見菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌性能，結果如表4所示。由表4可知，4株菌對於3種常見致病菌都有一定程度的抑菌作用。其中，Z3、Z6號菌株對大腸桿菌的抑制作用較明顯，相比較，Z6號菌株對3種常見致病菌的抑制作用比Z3號菌株強。
3.4 菌株的耐藥性能 主要測定Z2、Z3、Z6、和Z7號菌株對常用八大類抗生素的耐藥性能，通過實驗可知菌株對抗生素類藥的物敏感性，其結果如表5所示。由表5可知，Z2菌株對青黴素類、四環素類、糖肽類具有耐藥性;Z7菌株對青黴素類、大環內酯類、喹諾酮類具有耐藥性，對糖肽類中度耐藥;Z3對四環素類具有耐藥性、糖肽類中度耐藥;Z6僅對糖肽類中度耐藥。綜合比較菌株Z3與Z6的耐藥類型較少，安全性較高。
4 結論
本研究通過碳酸鈣-MRS透明圈法初步篩選得到具有產透明圈能力的菌株10株，通過菌落形態觀察和革蘭氏染色初步判斷各菌株為乳酸菌，進一步測定菌株產乳酸能力，得到4株產乳酸量超過30mg/mL乳酸菌。4株菌對於腸道中常見有害菌均具有一定的抑制性，抑制性與產乳酸量有一定相關性，產酸量較高的Z3和Z6對有害菌的抑制性也較明顯。經抗生素耐藥性試驗表明，Z3和Z6這2株菌表現出了較好的安全性。最終篩選得到2株具有產酸性能強、腸道有害菌抑菌效果明顯且安全性高的菌株，可作為乳酸菌製劑或發酵食品添加劑的備選菌株。
參考文獻
[1]劉小翠，安志鵬，楊瑩，等.小米發酵液中高發酵性能乳酸菌的分離篩選與鑑定[J].食品科技，2020，45（08）：15-19.
[2]孫悅.抗耐藥性埃希氏大腸桿菌乳酸菌的篩選及抑菌機制研究[D].錦州：渤海大學，2020.
[3]袁丹丹，張曉元，郝榮華，等.產抑菌物質乳酸菌的篩選鑑定及生物學特性研究[J].生物技術，2019，29（04）：376-381.
[4]劉樹昕，吳愛娟，甄妮，等.廣譜抑菌乳酸菌的篩選及其細菌素相關基因分析[J].食品科學，2020，41（06）：101-107.
[5]高熳熳，焦新雅，張志勝，等.侗族傳統發酵酸肉中乳酸菌的篩選、發酵特性及安全性分析[J].食品工業科技，2020，41（12）：94-99，105.
（責編：張宏民）
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