作者：孫玲，王峰，孫慧，樂曉萍，葛秀峰，姜中興，張欽憲
【摘要】
為了 研究 hTERT基因反義寡核苷酸（ASODN）對HL-60細胞增殖及端粒酶活性的抑制作用，並探討HL-60細胞端粒酶活性與hTERT基因表達的關係， 應用 反義寡核苷酸封閉HL-60細胞hTERT基因的表達，RT-PCR 方法 檢測該基因表達抑制情況，倒置顯微鏡觀察細胞形態變化，MTT法檢測細胞增殖狀態，應用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法檢測HL-60細胞端粒酶活性。結果發現：反義硫代寡核苷酸作用於HL-60細胞72小時後，hTERT基因表達明顯受抑，細胞生長受抑，增殖能力減弱，其抑制作用具有序列特異性及濃度、時間依賴性。端粒酶活性檢測顯示：反義寡核苷酸10、20和30 μmol/L作用組OD450-690值分別為1.504±0.47、1.223±0.39，0.944±0.16，與未作用組（2.648±0.42）比較，差異有顯著性（P<0.05）；正義寡核苷酸20 μmol/L作用組（OD450-690值為2.376±065）與未作用組比較，差異無顯著性（P>0.05）。TRAP-PAGE檢測表明： hTERT ASODN作用組較SODN作用組端粒酶條帶明顯減少，以30 μmol/L作用組條帶最少。結論： hTERT基因反義寡核苷酸能夠通過封閉hTERT基因的表達而抑制HL-60細胞增殖，下調端粒酶活性。
【關鍵詞】HL-60細胞； hTERT； 反義寡核苷酸； 端粒酶活性
Inhibition of hTERT Antisense Oligodeoxynucleotide on Proliferation and Telomerase Activity in HL-60 Cells
Abstract This study was purposed to investigate the inhibition of hTERT antisense oligodeoxynucleotide(ASODN) on the proliferation and telomerase activity in HL-60 cells and to explore the relativity between the telomerase activity and the expression of hTERT gene in HL-60 cells. After treated by hTERT ASODN the expression of hTERT was detected by RT-PCR，the morphological changes of HL-60 cells was observed with inverted microscopy，the cell proliferation was measured by MTT method，and the telomerase activity was determined with TRAP-ELISA and TRAP-PAGE. The results showed that after sealing hTERT gene with ASODN for 72 hours，the expression of hTERT gene was significantly inhibited，the cell growth was repressed and the ability of proliferation decreased，and the effect was specific in sequence and dependent in dose and time. OD450-690 values were 2.648±0.42，1.504±0.47，1.223±0.39，0.944±0.16 respectively，as the cells were treated with 0，10，20，30 μmol/L ASODN for 72 hours. The difference was significant as compared 10，20，30 μmol/L groups with 0 μmol/L ASODN group respectively (P<0.05)，but the difference was no significant when compared 20 μmol/L SODN group (2.376±0.65) with untreated group (2.648±0.42) (P>0.05). TRAP-PAGE detection revealed that comparing ASODN groups with SODN groups the telomerase image bands were decreased and least was found in groups of 30 ±mol/L. It is concluded that the hTERT ASODN may inhibit the proliferation and down-regulate the telomerase activity in HL-60 cells by sealing the expression of hTERT gene.
Key words HL-60 cell; hTERT; antisense oligodeoxynucleotide; telomerase activity
端粒是真核細胞染色體末端特有的保護性結構，它能維持染色體末端的完整性。隨著細胞的分裂、分化，端粒逐漸縮短，當端粒縮短至一定程度，細胞將出現衰老、死亡。端粒酶是一種逆轉錄酶，它能合成端粒並接到染色體末端，補充由於DNA分裂造成的端粒縮短，從而維持端粒長度，使細胞永生化［1］。研究表明：端粒酶活性增高與許多腫瘤的發生密切相關，在急性白血病中存在端粒酶的高表達［2］。人們普遍認為，端粒酶活化是腫瘤細胞無限增殖的必要條件。抑制端粒酶的活性可以達到抑制腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡的目的。人類端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTRET）基因與端粒酶活性具有直接相關性［3］。我們利用反義技術將hTERT反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASODN）導入人類髓性白血病細胞株HL-60細胞，探討其對白血病細胞的增殖及端粒酶活性的 影響 ，為開闢白血病 治療 新途徑提供有價值的實驗室資料。
材料和方法
細胞培養
HL-60細胞為鄭州大學醫學院組胚教研室保存株，採用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，將HL-60細胞置37℃、5% CO2、飽和濕度的恆溫孵箱中培養。實驗選用對數生長期細胞，細胞懸浮成團，生長良好，隔天換液並傳代1次，成活率>95%。
反義核酸的設計與合成
選擇端粒酶hTERT mRNA轉譯起始區作為靶點合成全硫代修飾的反義寡核苷酸（ASODN）片段；另設正義全硫代修飾的寡核苷酸（SODN）片段作為對照。合成序列如下： h-ASODN: 5』-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3』；
h-SODN: 5』-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3』。
經 計算 機檢索證實，反義片段與其它已知的人類基因無同源性。所有寡核苷酸均由上海Sangon生物工程技術服務公司391型DNA合成儀(PE公司)合成，並純化、分裝，-20℃保存待用。
轉染及藥物敏感試驗
按照OligofectamineTM Reagent(Invitrogen公司)說明書步驟，將純化的ASODN、SODN溶於不含抗生素及胎牛血清的RPMI 1640培養液中，每組濃度分別為5、10、20、30 μmol/L。取2.5 μl不同濃度的ASODN分別加入40 μl無血清培養液，此為Ａ液；6 μl無血清培養液中加入1.5 μl轉染液，室溫孵育10分鐘，此為Ｂ液。將Ｂ液分別加入Ａ液中，輕輕混勻，室溫放置15-20分鐘。同時取對數生長期的HL-60細胞200 μl (含細胞1.5×105)，加入A、B液調成250 μl，接種於24孔板中，置5% CO2孵箱中轉染4小時後，加入新鮮的含30%胎牛血清的RPMI 1640液125 μl繼續培養，每個濃度組均設立3個平行復孔。同時設未作用組為空白對照(即不加任何寡核苷酸作用的HL-60細胞)。分別培養24、48、72、96小時，用MTT法測定細胞生長抑制率。測定前4小時加入MTT液，4小時後加入溶解液DMSO，待結晶完全溶解後於全自動酶標儀上在波長490 nm處測定每孔吸光度OD490。計算生長抑制率：生長抑制率=［(未處理組吸光度-處理組吸光度)/未處理組吸光度］×100%
細胞形態學觀察
在細胞培養狀態下，用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態及形態學改變。
細胞增殖能力檢測
取對數生長期HL-60細胞，調整細胞濃度為5×104/ml。用20 μmol/L ASODN、SODN分別轉染細胞，每組設3個復孔。常規培養24、48、72、96小時後採用4 g/L台盼藍染色，計數板計數法進行細胞計數，以時間為橫軸，細胞數為縱軸繪製生長曲線。
轉染細胞hTERT mRNA表達的檢測
於轉染後72小時收集不同處理組HL-60細胞3×106個，以TRIZOL RNA提取試劑盒提取細胞的總RNA。採用AMV一步法RT-PCR試劑盒檢測hTERT mRNA的表達。hTERT上游引物： 5』-CTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC-3』，hTERT下游引物: 5』- GGGCTGCTGGTGTCTGCTCTCG-3』；以β-actin為內參照，上游引物：5』-TCCTGTGGCATCCACGAAA-CT-3』，下游引物：5』-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3』。產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結果並拍照成像。
端粒酶活性檢測
用Telomerase PCR ELISA試劑盒（Roche公司產品）進行檢測。
端粒酶提取物的製備 收集2×105個細胞，用PBS洗2次，加入200 μl裂解液。充分混勻，4℃裂解30分鐘，16 000×g離心10分鐘，小心地將上清(約175 μl)移至另一潔凈管中，-70℃保存備用或即用。紫外吸收法測定蛋白質含量。陽性對照為人胚腎細胞293細胞株(試劑盒提供)，陰性對照為端粒酶提取物加1 μg/μl RNase A，37℃孵育20分鐘。
RT-PCR擴增 取上述提取液5-20 μl(蛋白質含量10 μg)加入25 μl 反應混合液，用無菌DEPC水補充至50 μl，加入PCR擴增管。PCR擴增: 25℃引物延伸30分鐘;94℃端粒酶滅活5分鐘;擴增反應: 94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 90秒，循環30次;72℃平衡10分鐘。
端粒酶活性的TRAP-ELISA檢測
取上述PCR產物5 μl加變性液20 μl混勻，室溫放置10分鐘，加入225 μl雜交液(含地高辛標記的探針)，混勻後取出100 μl放於包被抗生物素的酶標板中，20℃作用2小時，加入過氧化物酶並與TMB底物顯色30分鐘，最後加終止液100 μl，用時間分辨螢光儀測定A值(波長為450 nm和690 nm)，A=OD450-OD690。A值代表細胞端粒酶活性。
聚丙烯凝膠電泳及銀染
配12%非變性聚丙烯凝膠，聚合1-2小時，小心取出梳子，立即沖洗加樣孔，加入擴增產物25 μl，130 V電泳1.5-2小時，(電泳50%的膠長)取出凝膠進行銀染。先將凝膠放入10%的乙醇中固定10 分鐘，用ddH2O清洗1次；1%硝酸溶液中浸洗3分鐘，用ddH2O清洗2次；0.2%硝酸銀浸洗30分鐘進行染色，用ddH2O清洗2次；0.28 mol/L碳酸鈉並0.019%甲醛顯色至特異性梯形條帶現出；10%醋酸浸洗2分鐘進行分化去除背景雜色，自來水沖洗，數位相機照像。
統計學處理
數據應用均數±標準差(X ±SD)表示，兩樣本均數比較採用t檢驗，多樣本均數的比較採用方差 分析 。以α =0.05為檢驗水準。
結果
hTERT ASODN對HL-60細胞生長的影響
不同濃度ASODN對HL-60細胞的生長均有抑制作用，且抑制率與劑量呈正相關，第24、48、72和96小時相關係數分別為0.951、0959、0.960、0.958（P<0.05）。抑制作用於轉染後72小時最明顯，以後則下降。SODN組抑制作用不明顯，與ASODN組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。
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