劉慶1,2，朱世楊1,2，張小玲1,2，朱婷婷2，羅天寬1,2
（1溫州市農業科學研究院，浙江溫州325006；2溫州科技職業學院，浙江溫州325006）摘要：為給『甌雪60 天』制種母本9901A（隱性核不育系）的快速繁殖提供依據，研究了花椰菜花球採收期、20 cm抽薹期、開花期不同部位取材外植體對誘導培養的影響。結果表明：不同生育階段不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。不同階段不同部位外植體誘導出芽效果存在差異，以開花期花托誘導出芽數量最多，採收期3 mm厚花枝誘導出芽數量次之，20 cm抽薹期則誘導不出芽。4℃低溫處理1 天採收期花球表面花枝的誘導效果較好，而低溫處理3、7 天的誘導效果有所降低。
關鍵詞 ：外植體選取；低溫處理；花椰菜不育系；誘導培養
中圖分類號：S635.3 文獻標誌碼：A 論文編號：2014-0205
基金項目：溫州市科技計劃項目「甌雪60 天花椰菜制種技術研究及開發利用」(N20100060)，「松花型花椰菜種質資源創新與新品種選育研究」(N20110001)。
第一作者簡介：劉慶，男，1979 年出生，浙江蒼南人，助研，本科，主要從事花椰菜育種研究。通信地址：325006 溫州市六虹橋路1000 號溫州市農業科學研究院，Tel：0577-86181080，E-mail：35147127@.com。
通訊作者：朱世楊，男，1982 年出生，江蘇如皋人，講師，碩士，主要從事花椰菜育種與植物生理研究。通信地址：325006 溫州市六虹橋路1000 號溫州市農業科學研究院，Tel：0577-86181080，E-mail：zhushiyang2000@163.com。
收稿日期：2014-03-10，修回日期：2014-07-05。
0 引言
『甌雪60 天』是溫州市農業科學研究院利用花椰菜隱性細胞核雄性不育系9901A 為母本，優良自交系9908 為父本，培育而成的花椰菜雜交組合。該組合於2009 年12 月通過浙江省非主要農作物品種審定委員會審定，審定編號為浙（非）審蔬20090016。該組合已在浙江溫州、四川成都等地方大面積推廣應用。由於『甌雪60 天』制種母本9901A 系隱性細胞核雄性不育系，不易通過種子繁殖母本進行制種，限制了其大規模的推廣應用。應用植物組織培養技術可以繁殖保持花椰菜的優良特性。前人已經開展了一些花椰菜組織培養方面研究。如吳麗芳等[1]以花球為外植體研究了花椰菜不育系組培快繁和無糖生產技術；張小玲等[2]以未受精子房、花托、花序軸為外植體進行了花椰菜離體培養誘導成苗研究；黃俊軒等[3]以花椰菜葉片為外植體研究了其離體再生技術；許端祥等[4]則以腋芽為材料開展了花椰菜自交不親和系的組培快繁研究。然而，關於花椰菜隱性細胞核雄性不育系不同生育階段不同部位外植體誘導培養的研究尚未見報道。為此，筆者以『甌雪60 天』核不育系母本9901A 為材料，開展不同生育階段不同部位取材外植體對誘導培養影響的研究，以為『甌雪60 天』制種母本快速繁殖提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗設計
1.1.1 外植體選取處理以『甌雪60 天』母本9901A 花球採收期（2010 年12 月30 日）、20 cm抽薹期（2011 年1月21 日）、開花期（2011 年3 月10 日）3 個生育階段不同部位外植體為接種材料，設置處理：（1）採收期花球表面3 mm厚花枝；（2）20 cm 抽薹期由上端往下數的頂端以及第一、二、三分枝（圖1 左）；（3）開花期由頂端往下數的花托、花柄以及第一、二分枝（圖1 右）。
1.1.2 外植體低溫處理以『甌雪60 天』母本9901A 採收期花球表面3 mm厚花枝為接種材料，於4℃冰箱中分別低溫處理0、1、3、7 天，然後供接種用。
1.2 誘導培養
1.2.1 誘導培養基配方所用培養基為MS+2,4-D0.01mg/L+BA 1 mg/L +NAA 0.001 mg/L，蔗糖濃度為3.0%，瓊脂濃度為0.7%，pH 5.8。
1.2.2 無菌接種誘導培養取上述外植體無菌接種，然後置於培養室（溫度24±2℃，每天光照12 h，黑暗12 h）中誘導培養。接種時將外植體切成2~3 mm，每瓶接種5 小塊，每處理接種30 瓶。50 天后，隨機挑選4 瓶，統計愈傷組織誘導率和誘導芽數。
愈傷組織誘導率=(帶有愈傷組織外植體數/接種外植體數)×100%；
誘導芽數=誘導出的芽數/接種外植體數。
1.3 數據分析
數據用Excel分析軟體進行統計和分析。
2 結果與分析
2.1 外植體選取時期和部位對花椰菜誘導培養的影響
由表1 可知，『甌雪60 天』母本9901A花球採收期、20 cm抽薹期、開花期3 個生育階段不同部位外植體接種後愈傷組織誘導率均100%。但是，不同生育階段不同取材部位外植體的誘導出芽數存在差異。其中，採收期3 mm厚花枝誘導芽數為3 個/外植體；20 cm抽苔期各部位取材均誘導不出芽；開花期花托、花柄以及第一、二分枝誘導芽數分別為3.7、2.7、2.7、1.2 個/外植體。
2.2 外植體低溫處理時間對花椰菜誘導培養的影響
由表2 可以看出，適宜時間的4℃低溫處理可以提高花椰菜採收期花球表面3 mm厚花枝的誘導效果。其中4℃低溫處理0、1、3 天，愈傷組織誘導率均為100%；4℃低溫處理7 天，愈傷組織誘導率則降為75%。4℃低溫處理0、1、3、7 天，誘導芽數分別為3、5、2.5、1 個/外植體。說明，外植體4℃低溫處理1 天誘導效果最佳。
3 結論與討論
『甌雪60 天』母本9901A 為隱性核基因控制的不育系，沒有保持系，無法自身繁殖，用組織培養方法可以在短期內擴繁獲得大量不育系種苗，滿足生產上制種的需要[5]。誘導培養是花椰菜組織培養的一個關鍵階段，所用外植體可以是未受精子房、花托、花序軸、葉片、葉柄、腋芽、莖節段、花球等組織器官，但不同外植體及其選取時期與部位對誘導效果產生的影響可能不同[1-4,6-8]。因此，對『甌雪60 天』母本9901A 不同生育階段不同部位取材外植體誘導培養研究具有重要的意義。
本研究發現，『甌雪60 天』母本花球採收期、20 cm抽薹期、開花期3 個生育階段不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。說明取材時期和部位對花椰菜愈傷組織誘導影響不大。這與李曙軒和裘文達在『80 天』花椰菜花球組織或花序柄組織培養中發現有90%~100%的切段都能形成愈傷組織的結論基本一致[8]。但是，花椰菜誘導出芽效果因外植體取材時期和部位而異，其中開花期花托誘導出芽效果最好，採收期3 mm厚花枝效果次之，而20 cm抽苔期則誘導不出芽。說明，開花期花托是『甌雪60 天』母本誘導培養的理想材料。這與張小玲等以花椰菜『圓葉80 天』和『青葉100 天』為材料，研究發現花椰菜誘導出芽數量以花托為最多的結果是一致的[2]。
低溫處理能夠促進植物誘導培養。本研究還發現，花椰菜採收期花球外植體4℃低溫處理1 天，誘導芽數最多，而4℃低溫處理3、7 天愈傷組織誘導率和芽數均有所降低。說明，4℃低溫處理1 天誘導效果最佳，也表明低溫處理能夠促進愈傷組織誘導及芽分化。這與前人在結苜蓿[9]、縷草[10]、擬南芥菜[11]、小麥[12]、馬鈴薯[13]、油茶[14]、胡麻[15]等研究結果有所類似，但這一結果的具體作用原理還有待進一步的探討研究。在實際生產中，可以考慮將母本採收期割球採下的花枝4℃貯藏後接種誘導培養，既能提高誘導芽數，又可提高割球採下花枝的利用價值，而不會影響單株花數降低種子產量；同時可提早進入增值擴繁提高組培效率。
綜上所述，『甌雪60 天』母本花球採收期、20 cm抽薹期、開花期不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。但是誘導出芽效果以開花期花托最好，採收期3 mm 厚花枝次之，20 cm 抽薹期誘導不出芽。4℃低溫處理1 天可以提高採收期花球表面花枝誘導效果，但低溫處理3、7 天后誘導效果有所降低。本試驗結果是基於單個花椰菜不育系品種誘導培養的，研究結果是否適用於其它花椰菜不育系材料尚需進行驗證。此外，誘導培養僅僅是花椰菜組織培養的一個階段，還需對其繼代培養和生根培養做進一步的探索。
參考文獻
[1] 吳麗芳，蔣亞蓮，張藝萍，等.花椰菜雄性不育系組織快繁及無糖培養技術[J].北方園藝，2009(6)：57-58.
[2] 張小玲，張純胄，唐征，等.花椰菜未受精子房、花托、花序軸離體培養誘導成苗研究[J].長江蔬菜，2000(1)：28-30.
[3] 黃俊軒，李雙躍，李建科，等.花椰菜葉片離體再生技術的研究[J].天津農學院學報，2006，13(4)：21-23.
[4] 許端祥，方淑桂，陳文輝.花椰菜自交不親和系組培快繁技術研究[J].福建農業科技，2006(5)：32-34.
[5] 張小玲，唐征，劉慶， 等.花椰菜雄性不育突變株的發現及利用[J].核農學報，2012，26(3)：450-453.
[6] 陳文輝，方淑桂，朱朝輝，等.花椰菜雄性不育系的選育與應用[J].福 建農業學報，2010，25(5)：580-583.
[7] 陶興林，胡立敏.花椰菜雄性不育材料的鑑定和繁殖[J].農業科技通訊，2008，2：54-55.
[8] 李曙軒，裘文達.花椰菜組織培養形成植株[J].園藝學報，1981，8(1)：33-36.
[9] 馬菊蘭，張博.低溫預處理和低溫預培養對苜蓿新品系花葯愈傷組織誘導的影響[J].中國草地學報，2007，29(6)：59-63.
[10] 朱曉花，孫吉雄，梁慧敏，等.低溫預處理與植物生長調節劑對結縷草愈傷組織誘導的影響[J].草業科學，2009，26(4)：121-126.
[11] 厲秀茹，王今朝，崔海英.低溫及碳源對擬南芥菜胚愈傷組織誘導和植株再生的影響[J].北京農學院學報，1997，12(3)：1-6.
[12] 孫春歧，於淑池，齊志廣.低溫對誘導小麥未成熟胚愈傷組織出愈率的影響研究[J].中國生態農業學報，2005，13(1)：60-61.
[13] 賀苗苗.溫度預處理對不同品種馬鈴薯花葯愈傷組織誘導率的影響[J].江蘇農業科學，2013，41(9)：32-33.
[14] 張日清，聞麗， 劉友全，等.低溫預處理對油茶花葯愈傷組織誘導的影響[J].中南林學院學報，2005，25(6)：24-28.
[15] 頡瑞霞，張建平，黨占海，等.激素和低溫預處理對胡麻花葯愈傷組織誘導的影響[J].分子植物育種，2009，7(6)：1180-1185.
（1溫州市農業科學研究院，浙江溫州325006；2溫州科技職業學院，浙江溫州325006）摘要：為給『甌雪60 天』制種母本9901A（隱性核不育系）的快速繁殖提供依據，研究了花椰菜花球採收期、20 cm抽薹期、開花期不同部位取材外植體對誘導培養的影響。結果表明：不同生育階段不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。不同階段不同部位外植體誘導出芽效果存在差異，以開花期花托誘導出芽數量最多，採收期3 mm厚花枝誘導出芽數量次之，20 cm抽薹期則誘導不出芽。4℃低溫處理1 天採收期花球表面花枝的誘導效果較好，而低溫處理3、7 天的誘導效果有所降低。
關鍵詞 ：外植體選取；低溫處理；花椰菜不育系；誘導培養
中圖分類號：S635.3 文獻標誌碼：A 論文編號：2014-0205
基金項目：溫州市科技計劃項目「甌雪60 天花椰菜制種技術研究及開發利用」(N20100060)，「松花型花椰菜種質資源創新與新品種選育研究」(N20110001)。
第一作者簡介：劉慶，男，1979 年出生，浙江蒼南人，助研，本科，主要從事花椰菜育種研究。通信地址：325006 溫州市六虹橋路1000 號溫州市農業科學研究院，Tel：0577-86181080，E-mail：35147127@.com。
通訊作者：朱世楊，男，1982 年出生，江蘇如皋人，講師，碩士，主要從事花椰菜育種與植物生理研究。通信地址：325006 溫州市六虹橋路1000 號溫州市農業科學研究院，Tel：0577-86181080，E-mail：zhushiyang2000@163.com。
收稿日期：2014-03-10，修回日期：2014-07-05。
0 引言
『甌雪60 天』是溫州市農業科學研究院利用花椰菜隱性細胞核雄性不育系9901A 為母本，優良自交系9908 為父本，培育而成的花椰菜雜交組合。該組合於2009 年12 月通過浙江省非主要農作物品種審定委員會審定，審定編號為浙（非）審蔬20090016。該組合已在浙江溫州、四川成都等地方大面積推廣應用。由於『甌雪60 天』制種母本9901A 系隱性細胞核雄性不育系，不易通過種子繁殖母本進行制種，限制了其大規模的推廣應用。應用植物組織培養技術可以繁殖保持花椰菜的優良特性。前人已經開展了一些花椰菜組織培養方面研究。如吳麗芳等[1]以花球為外植體研究了花椰菜不育系組培快繁和無糖生產技術；張小玲等[2]以未受精子房、花托、花序軸為外植體進行了花椰菜離體培養誘導成苗研究；黃俊軒等[3]以花椰菜葉片為外植體研究了其離體再生技術；許端祥等[4]則以腋芽為材料開展了花椰菜自交不親和系的組培快繁研究。然而，關於花椰菜隱性細胞核雄性不育系不同生育階段不同部位外植體誘導培養的研究尚未見報道。為此，筆者以『甌雪60 天』核不育系母本9901A 為材料，開展不同生育階段不同部位取材外植體對誘導培養影響的研究，以為『甌雪60 天』制種母本快速繁殖提供參考。
1 材料與方法
1.1 試驗設計
1.1.1 外植體選取處理以『甌雪60 天』母本9901A 花球採收期（2010 年12 月30 日）、20 cm抽薹期（2011 年1月21 日）、開花期（2011 年3 月10 日）3 個生育階段不同部位外植體為接種材料，設置處理：（1）採收期花球表面3 mm厚花枝；（2）20 cm 抽薹期由上端往下數的頂端以及第一、二、三分枝（圖1 左）；（3）開花期由頂端往下數的花托、花柄以及第一、二分枝（圖1 右）。
1.1.2 外植體低溫處理以『甌雪60 天』母本9901A 採收期花球表面3 mm厚花枝為接種材料，於4℃冰箱中分別低溫處理0、1、3、7 天，然後供接種用。
1.2 誘導培養
1.2.1 誘導培養基配方所用培養基為MS+2,4-D0.01mg/L+BA 1 mg/L +NAA 0.001 mg/L，蔗糖濃度為3.0%，瓊脂濃度為0.7%，pH 5.8。
1.2.2 無菌接種誘導培養取上述外植體無菌接種，然後置於培養室（溫度24±2℃，每天光照12 h，黑暗12 h）中誘導培養。接種時將外植體切成2~3 mm，每瓶接種5 小塊，每處理接種30 瓶。50 天后，隨機挑選4 瓶，統計愈傷組織誘導率和誘導芽數。
愈傷組織誘導率=(帶有愈傷組織外植體數/接種外植體數)×100%；
誘導芽數=誘導出的芽數/接種外植體數。
1.3 數據分析
數據用Excel分析軟體進行統計和分析。
2 結果與分析
2.1 外植體選取時期和部位對花椰菜誘導培養的影響
由表1 可知，『甌雪60 天』母本9901A花球採收期、20 cm抽薹期、開花期3 個生育階段不同部位外植體接種後愈傷組織誘導率均100%。但是，不同生育階段不同取材部位外植體的誘導出芽數存在差異。其中，採收期3 mm厚花枝誘導芽數為3 個/外植體；20 cm抽苔期各部位取材均誘導不出芽；開花期花托、花柄以及第一、二分枝誘導芽數分別為3.7、2.7、2.7、1.2 個/外植體。
2.2 外植體低溫處理時間對花椰菜誘導培養的影響
由表2 可以看出，適宜時間的4℃低溫處理可以提高花椰菜採收期花球表面3 mm厚花枝的誘導效果。其中4℃低溫處理0、1、3 天，愈傷組織誘導率均為100%；4℃低溫處理7 天，愈傷組織誘導率則降為75%。4℃低溫處理0、1、3、7 天，誘導芽數分別為3、5、2.5、1 個/外植體。說明，外植體4℃低溫處理1 天誘導效果最佳。
3 結論與討論
『甌雪60 天』母本9901A 為隱性核基因控制的不育系，沒有保持系，無法自身繁殖，用組織培養方法可以在短期內擴繁獲得大量不育系種苗，滿足生產上制種的需要[5]。誘導培養是花椰菜組織培養的一個關鍵階段，所用外植體可以是未受精子房、花托、花序軸、葉片、葉柄、腋芽、莖節段、花球等組織器官，但不同外植體及其選取時期與部位對誘導效果產生的影響可能不同[1-4,6-8]。因此，對『甌雪60 天』母本9901A 不同生育階段不同部位取材外植體誘導培養研究具有重要的意義。
本研究發現，『甌雪60 天』母本花球採收期、20 cm抽薹期、開花期3 個生育階段不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。說明取材時期和部位對花椰菜愈傷組織誘導影響不大。這與李曙軒和裘文達在『80 天』花椰菜花球組織或花序柄組織培養中發現有90%~100%的切段都能形成愈傷組織的結論基本一致[8]。但是，花椰菜誘導出芽效果因外植體取材時期和部位而異，其中開花期花托誘導出芽效果最好，採收期3 mm厚花枝效果次之，而20 cm抽苔期則誘導不出芽。說明，開花期花托是『甌雪60 天』母本誘導培養的理想材料。這與張小玲等以花椰菜『圓葉80 天』和『青葉100 天』為材料，研究發現花椰菜誘導出芽數量以花托為最多的結果是一致的[2]。
低溫處理能夠促進植物誘導培養。本研究還發現，花椰菜採收期花球外植體4℃低溫處理1 天，誘導芽數最多，而4℃低溫處理3、7 天愈傷組織誘導率和芽數均有所降低。說明，4℃低溫處理1 天誘導效果最佳，也表明低溫處理能夠促進愈傷組織誘導及芽分化。這與前人在結苜蓿[9]、縷草[10]、擬南芥菜[11]、小麥[12]、馬鈴薯[13]、油茶[14]、胡麻[15]等研究結果有所類似，但這一結果的具體作用原理還有待進一步的探討研究。在實際生產中，可以考慮將母本採收期割球採下的花枝4℃貯藏後接種誘導培養，既能提高誘導芽數，又可提高割球採下花枝的利用價值，而不會影響單株花數降低種子產量；同時可提早進入增值擴繁提高組培效率。
綜上所述，『甌雪60 天』母本花球採收期、20 cm抽薹期、開花期不同部位取材外植體的愈傷組織誘導率均為100%。但是誘導出芽效果以開花期花托最好，採收期3 mm 厚花枝次之，20 cm 抽薹期誘導不出芽。4℃低溫處理1 天可以提高採收期花球表面花枝誘導效果，但低溫處理3、7 天后誘導效果有所降低。本試驗結果是基於單個花椰菜不育系品種誘導培養的，研究結果是否適用於其它花椰菜不育系材料尚需進行驗證。此外，誘導培養僅僅是花椰菜組織培養的一個階段，還需對其繼代培養和生根培養做進一步的探索。
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[5] 張小玲，唐征，劉慶， 等.花椰菜雄性不育突變株的發現及利用[J].核農學報，2012，26(3)：450-453.
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[15] 頡瑞霞，張建平，黨占海，等.激素和低溫預處理對胡麻花葯愈傷組織誘導的影響[J].分子植物育種，2009，7(6)：1180-1185.