【關鍵詞】,腫瘤
Apoptosis of tumor cells induced by mutant and wild type TNFα
【Abstract】 AIM: To compare the apoptosisinduced ability of recombinant human mutant type 471 rhTNFα (mt 471rhTNFα) with that of wild type rhTNFα (wt rhTNFα) and to study the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. METHODS: The apoptosis of ZR751 cells, a breast cancer cell line, induced by mt 471rhTNFα or wt rhTNFα was analyzed and compared by 20 g/L agarose gel electrophoresis and flow cytometry techniques. The activation profiles of nuclear factor NFκB in ZR751 cells untreated and treated by mt 471rhTNFα or wt rhTNFα were detected using Trans AMTM NFκB p65 kit based on ELISA for further study of the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. RESULTS: The results from 20 g/L agarose gel electrophoresis of genomic DNA indicated that ZR751 cells treated by mt 471rhTNFα provided a typical apoptotic ladder pattern of DNA fragmentation, whereas weakened ladders were observed in ZR751 cells treated by wt rhTNFα. Flow cytometry showed that the cell apoptotic rate in mt 471rhTNFα treated group was 43%, but 25% in wt rhTNFα treated group. The mt 471rhTNFα held a strong apoptosisinducible ability. The results of DNAbinding activity of NFκB showed that NFκB activation induced by wt rhTNFα was significantly higher than that of mt 471rhTNFα when the protEin concentration of mt 471rhTNFα or wt rhTNFα reached 50 μg/L (P=0.002). CONCLUSION: The apoptosisinduced ability of mt 471rhTNFα is superior to that of wt rhTNFα. One of the possible reasons for the enhanced apoptosisinduced ability may be that NFκB activation is inhibited in tumor cells treated with mt 471rhTNFα.
【Keywords】 neoplasms; mutant type 471rhTNFα; wild type rhTNFα; NFkappaB; apoptosis
【摘要】 目的： 比較重組人突變型471rhTNFα（mt 471rhTNFα）與野生型rhTNFα（wt rhTNFα）誘導腫瘤細胞發生凋亡的能力，並對mt 471rhTNFα誘導腫瘤細胞發生凋亡的作用機制進行初步 研究 . 方法 ： 以乳腺癌細胞系ZR751細胞為靶細胞， 應用 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳及流式細胞技術 分析 mt 471rhTNFα與wt rhTNFα誘導腫瘤細胞凋亡的情況；利用以ELISA為基礎的Trans AMTM NFκB p65試劑盒檢測經mt 471rhTNFα或wt rhTNFα處理的ZR751細胞核因子NFκB的活化情況，以便對其誘導凋亡的機制進行初步的研究. 結果： 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示，mt 471rhTNFα處理組的ZR751細胞基因組DNA呈現明顯的ladder狀分布，wt rhTNFα處理組的「ladder」條帶明顯減弱；流式細胞儀分析顯示，mt 471rhTNFα誘導的細胞凋亡峰面積高於wt rhTNFα處理組. NFκB活化檢測結果顯示，當兩型rhTNFα濃度增高到50 μg/L時，wt rhTNFα處理組的NFκB的活化量明顯高於同濃度的mt 471rhTNFα處理組（P=0.002）. 結論： mt 471rhTNFα誘導腫瘤細胞凋亡的能力明顯優於wt rhTNFα；腫瘤細胞內NFκB活化明顯受抑是mt 471rhTNFα誘導凋亡能力增強的主要原因之一.
【關鍵詞】 腫瘤；突變型471rhTNFα；野生型rhTNFα； NFκB；細胞凋亡
0引言
人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNFα），主要由巨噬細胞產生，是具有多種生物學活性的細胞因子. mt 471rhTNFα是刪除wt TNFαN端的7個胺基酸，並將Pro8Ser9Asp10置換為Arg8Lys9Arg10［1］的突變體. 這種突變並不改變TNFα分子的高級結構，仍然形成具有生物活性狀態的三聚體，抗腫瘤作用增強且毒副作用降低，極具開發價值. 我們在獲得mt 471rhTNFα重組蛋白的基礎上［2-4］，進行新的研究，為mt 471rhTNFα的臨床前研究提供實驗依據.
1材料和方法
1.1材料
兩種基因工程蛋白在大腸桿菌DH5α中進行表達，初步檢測具有良好的生物學活性. 乳腺癌細胞系（ZR751）為本室保存. 細胞培養基RPMI1640系GIBCO BRL產品，FCS購自杭州四季青生物技術公司. Trans AMTM NFκB p65 Kit由晶美生物工程有限公司提供. 胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒由碧雲天生物技術研究所提供.
1.2方法
1.2.1確定mt 471rhTNFα與wt rhTNFα濃度蛋白溶解液溶解冷凍乾燥蛋白，按1∶100稀釋，測定280 nm和260 nm下的A值，確定蛋白的濃度；另取10 μL加等體積2×蛋白電泳載樣液，行150 g/L SDSPAGE凝膠電泳，BackMan光密度掃描儀進行薄層掃描，以確定目的蛋白的含量.
1.2.2兩型rhTNFα誘導細胞凋亡復甦ZR751細胞，傳代培養至對數生長期，胰蛋白酶消化，Hank's液終止消化，收集細胞，並調整細胞數至2×108/L. 將細胞分為3組，即ZR751對照組、wt rhTNFα和mt 471rhTNFα處理組. 培養基中放線菌素D的終濃度為0.5 μg/L，樣品終濃度為0.1 mg/L，於加藥後12 h收集細胞. 將細胞分為兩部分，一部分用於20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，另一部分用於流式細胞分析，以PBS洗滌細胞，RNase降解RNA, 700 mL/L乙醇固定，待用. 檢測時，PBS洗滌以棄除700 mL/L乙醇，空干，碘化丙啶（PI）避光染色15 min以上. PBS洗滌後，將細胞重新懸於1 mL PBS中，用EPICS ELITE, COULTER, USA型流式細胞儀分析比較兩型TNFα誘導細胞凋亡的情況.
1.2.3核蛋白的提取並定量按1.2.2的處理方法復甦並傳代ZR751細胞，但樣品終濃度分別為10 μg/L和50 μg/L，作用4 h後收集細胞，分別提取各實驗組的細胞核蛋白質，操作按試劑盒說明書進行，即： 用PBS洗滌細胞，20 μL細胞沉澱加入200 μL細胞漿蛋白抽提試劑，振蕩5 s將細胞沉澱充分懸浮，加細胞漿蛋白抽提試劑B 10 μL. 高速振蕩5 s，冰浴1 min. 4 ℃, 12～16 kg,離心5 min，吸取上清至預冷的塑料管中，即為細胞漿蛋白.在沉澱中加入50μL細胞核蛋白抽提試劑，劇烈振蕩15~30 s，把沉澱完全懸浮. 冰浴，每隔1~2 min再高速劇烈振蕩15~30 s，共30 min. 4℃, 12～16 kg,離心10 min，吸取上清至預冷的塑料管中，即為細胞核蛋白，紫外分光光度計下進行蛋白定量，-70℃凍存.
1.2.4基於ELISA法的NFκB活性檢測操作按照Trans AMTM NFκB p65試劑盒說明書進行，簡介如下： 加入3 μg的細胞核蛋白抽提物，室溫孵育1 h，期間溫和搖動96孔板，使之均勻地結合；用200 μL的洗滌buffer洗滌3次，加入100 μL 以1∶1000稀釋的NFκB抗體，勿搖動，室溫下孵育1 h；用200 μL 的洗滌buffer洗滌3次，加入100 μL 以1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶聚合的二抗，室溫下孵育1 h；用200 μL 的洗滌buffer洗滌4次，室溫下每孔中加入100 μL的展呈液，及時觀察顏色的變化，直到培養基的顏色變為深藍色時加入100 μL 的終止液，遇酸時，藍色變為黃色，測定450 nm下的A值. 利用試劑盒中提供的突變寡核苷酸進行NFκB特異性結合為對照.
統計學處理： 以SPSS 11.0軟體進行統計學分析，兩實驗組NFκB的活性檢測分析採用t檢驗，P<0.05認為有統計學差異.
2結果
2.1mt 471rhTNFα與野生型rhTNFα的濃度由兩樣品的SDSPAGE結果及BackMan光密度掃描儀薄層掃描結果可知，目的蛋白的純度為96.7%和93.1%；紫外分光光度法測定A280 nm和A260 nm吸光度值，可知wt rhTNFα蛋白的產量為3.48 g/L, mt 471rhTNFα蛋白的產量為5.25 g/L.
2.2誘導ZR751細胞凋亡的檢測ZR751細胞在含有放線菌素D的培養液中，在mt 471rhTNFα與wt rhTNFα處理組中，分別加入10 μg/L的mt 471rhTNFα與wt rhTNFα，分別經兩樣本作用12 h後，進行細胞基因組DNA 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳. mt 471rhTNFα組的細胞基因組DNA降解成不同倍數的180~200 bp大小的片段，呈現明顯的ladder狀分布（Fig 1）.
2.3流式細胞儀檢測ZR751細胞凋亡與對照組相比，雖然兩實驗組均有凋亡峰出現，但mt 471rhTNFα誘導的凋亡峰面積占43%，wt rhTNFα誘導凋亡峰面積占25%, mt 471rhTNFα誘導的凋亡峰面積高於同濃度wt rhTNFα誘導組，對照組未見凋亡峰.
2.4不同實驗組ZR751中的NFκB活性實驗中，我們選擇了不同的TNFα濃度處理ZR751細胞，實驗結果可知(n=3)當兩型rhTNFα以濃度為10 μg/L作用於ZR751細胞4 h後，與對照組A均值0.6±0.03相比，wt rhTNFα和mt 471rhTNFα處理組的NFκB活化均有增加，其A均值分別為1.35±0.1732和0.9±0.1, wt rhTNFα處理組的NFκB活化增加量高於mt 471rhTNFα處理組（t=7.68, P=0.002）；當兩型TNFα濃度增高到50 μg/L時，wt rhTNFα處理組的增加量明顯增多其A均值為(3.48±0.13)，而mt 471rhTNFα處理組僅有輕度升高，A均值為(1.65±0.217)，兩實驗組間有顯著差異（t=12.49, P=0.000）；當樣品的濃度為100 μg/L時，特別是mt 471rhTNFα處理組的細胞有明顯的死亡，未見到明顯的NFκB活性改變；此外，兩個實驗組均未見到NFκB活化量隨TNFα作用時間的延長而增加， 在一定濃度範圍的TNFα作用下，細胞NFκB的活化有劑量依賴性.
Apoptosis of tumor cells induced by mutant and wild type TNFα
【Abstract】 AIM: To compare the apoptosisinduced ability of recombinant human mutant type 471 rhTNFα (mt 471rhTNFα) with that of wild type rhTNFα (wt rhTNFα) and to study the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. METHODS: The apoptosis of ZR751 cells, a breast cancer cell line, induced by mt 471rhTNFα or wt rhTNFα was analyzed and compared by 20 g/L agarose gel electrophoresis and flow cytometry techniques. The activation profiles of nuclear factor NFκB in ZR751 cells untreated and treated by mt 471rhTNFα or wt rhTNFα were detected using Trans AMTM NFκB p65 kit based on ELISA for further study of the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. RESULTS: The results from 20 g/L agarose gel electrophoresis of genomic DNA indicated that ZR751 cells treated by mt 471rhTNFα provided a typical apoptotic ladder pattern of DNA fragmentation, whereas weakened ladders were observed in ZR751 cells treated by wt rhTNFα. Flow cytometry showed that the cell apoptotic rate in mt 471rhTNFα treated group was 43%, but 25% in wt rhTNFα treated group. The mt 471rhTNFα held a strong apoptosisinducible ability. The results of DNAbinding activity of NFκB showed that NFκB activation induced by wt rhTNFα was significantly higher than that of mt 471rhTNFα when the protEin concentration of mt 471rhTNFα or wt rhTNFα reached 50 μg/L (P=0.002). CONCLUSION: The apoptosisinduced ability of mt 471rhTNFα is superior to that of wt rhTNFα. One of the possible reasons for the enhanced apoptosisinduced ability may be that NFκB activation is inhibited in tumor cells treated with mt 471rhTNFα.
【Keywords】 neoplasms; mutant type 471rhTNFα; wild type rhTNFα; NFkappaB; apoptosis
【摘要】 目的： 比較重組人突變型471rhTNFα（mt 471rhTNFα）與野生型rhTNFα（wt rhTNFα）誘導腫瘤細胞發生凋亡的能力，並對mt 471rhTNFα誘導腫瘤細胞發生凋亡的作用機制進行初步 研究 . 方法 ： 以乳腺癌細胞系ZR751細胞為靶細胞， 應用 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳及流式細胞技術 分析 mt 471rhTNFα與wt rhTNFα誘導腫瘤細胞凋亡的情況；利用以ELISA為基礎的Trans AMTM NFκB p65試劑盒檢測經mt 471rhTNFα或wt rhTNFα處理的ZR751細胞核因子NFκB的活化情況，以便對其誘導凋亡的機制進行初步的研究. 結果： 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示，mt 471rhTNFα處理組的ZR751細胞基因組DNA呈現明顯的ladder狀分布，wt rhTNFα處理組的「ladder」條帶明顯減弱；流式細胞儀分析顯示，mt 471rhTNFα誘導的細胞凋亡峰面積高於wt rhTNFα處理組. NFκB活化檢測結果顯示，當兩型rhTNFα濃度增高到50 μg/L時，wt rhTNFα處理組的NFκB的活化量明顯高於同濃度的mt 471rhTNFα處理組（P=0.002）. 結論： mt 471rhTNFα誘導腫瘤細胞凋亡的能力明顯優於wt rhTNFα；腫瘤細胞內NFκB活化明顯受抑是mt 471rhTNFα誘導凋亡能力增強的主要原因之一.
【關鍵詞】 腫瘤；突變型471rhTNFα；野生型rhTNFα； NFκB；細胞凋亡
0引言
人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNFα），主要由巨噬細胞產生，是具有多種生物學活性的細胞因子. mt 471rhTNFα是刪除wt TNFαN端的7個胺基酸，並將Pro8Ser9Asp10置換為Arg8Lys9Arg10［1］的突變體. 這種突變並不改變TNFα分子的高級結構，仍然形成具有生物活性狀態的三聚體，抗腫瘤作用增強且毒副作用降低，極具開發價值. 我們在獲得mt 471rhTNFα重組蛋白的基礎上［2-4］，進行新的研究，為mt 471rhTNFα的臨床前研究提供實驗依據.
1材料和方法
1.1材料
兩種基因工程蛋白在大腸桿菌DH5α中進行表達，初步檢測具有良好的生物學活性. 乳腺癌細胞系（ZR751）為本室保存. 細胞培養基RPMI1640系GIBCO BRL產品，FCS購自杭州四季青生物技術公司. Trans AMTM NFκB p65 Kit由晶美生物工程有限公司提供. 胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒由碧雲天生物技術研究所提供.
1.2方法
1.2.1確定mt 471rhTNFα與wt rhTNFα濃度蛋白溶解液溶解冷凍乾燥蛋白，按1∶100稀釋，測定280 nm和260 nm下的A值，確定蛋白的濃度；另取10 μL加等體積2×蛋白電泳載樣液，行150 g/L SDSPAGE凝膠電泳，BackMan光密度掃描儀進行薄層掃描，以確定目的蛋白的含量.
1.2.2兩型rhTNFα誘導細胞凋亡復甦ZR751細胞，傳代培養至對數生長期，胰蛋白酶消化，Hank's液終止消化，收集細胞，並調整細胞數至2×108/L. 將細胞分為3組，即ZR751對照組、wt rhTNFα和mt 471rhTNFα處理組. 培養基中放線菌素D的終濃度為0.5 μg/L，樣品終濃度為0.1 mg/L，於加藥後12 h收集細胞. 將細胞分為兩部分，一部分用於20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，另一部分用於流式細胞分析，以PBS洗滌細胞，RNase降解RNA, 700 mL/L乙醇固定，待用. 檢測時，PBS洗滌以棄除700 mL/L乙醇，空干，碘化丙啶（PI）避光染色15 min以上. PBS洗滌後，將細胞重新懸於1 mL PBS中，用EPICS ELITE, COULTER, USA型流式細胞儀分析比較兩型TNFα誘導細胞凋亡的情況.
1.2.3核蛋白的提取並定量按1.2.2的處理方法復甦並傳代ZR751細胞，但樣品終濃度分別為10 μg/L和50 μg/L，作用4 h後收集細胞，分別提取各實驗組的細胞核蛋白質，操作按試劑盒說明書進行，即： 用PBS洗滌細胞，20 μL細胞沉澱加入200 μL細胞漿蛋白抽提試劑，振蕩5 s將細胞沉澱充分懸浮，加細胞漿蛋白抽提試劑B 10 μL. 高速振蕩5 s，冰浴1 min. 4 ℃, 12～16 kg,離心5 min，吸取上清至預冷的塑料管中，即為細胞漿蛋白.在沉澱中加入50μL細胞核蛋白抽提試劑，劇烈振蕩15~30 s，把沉澱完全懸浮. 冰浴，每隔1~2 min再高速劇烈振蕩15~30 s，共30 min. 4℃, 12～16 kg,離心10 min，吸取上清至預冷的塑料管中，即為細胞核蛋白，紫外分光光度計下進行蛋白定量，-70℃凍存.
1.2.4基於ELISA法的NFκB活性檢測操作按照Trans AMTM NFκB p65試劑盒說明書進行，簡介如下： 加入3 μg的細胞核蛋白抽提物，室溫孵育1 h，期間溫和搖動96孔板，使之均勻地結合；用200 μL的洗滌buffer洗滌3次，加入100 μL 以1∶1000稀釋的NFκB抗體，勿搖動，室溫下孵育1 h；用200 μL 的洗滌buffer洗滌3次，加入100 μL 以1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶聚合的二抗，室溫下孵育1 h；用200 μL 的洗滌buffer洗滌4次，室溫下每孔中加入100 μL的展呈液，及時觀察顏色的變化，直到培養基的顏色變為深藍色時加入100 μL 的終止液，遇酸時，藍色變為黃色，測定450 nm下的A值. 利用試劑盒中提供的突變寡核苷酸進行NFκB特異性結合為對照.
統計學處理： 以SPSS 11.0軟體進行統計學分析，兩實驗組NFκB的活性檢測分析採用t檢驗，P<0.05認為有統計學差異.
2結果
2.1mt 471rhTNFα與野生型rhTNFα的濃度由兩樣品的SDSPAGE結果及BackMan光密度掃描儀薄層掃描結果可知，目的蛋白的純度為96.7%和93.1%；紫外分光光度法測定A280 nm和A260 nm吸光度值，可知wt rhTNFα蛋白的產量為3.48 g/L, mt 471rhTNFα蛋白的產量為5.25 g/L.
2.2誘導ZR751細胞凋亡的檢測ZR751細胞在含有放線菌素D的培養液中，在mt 471rhTNFα與wt rhTNFα處理組中，分別加入10 μg/L的mt 471rhTNFα與wt rhTNFα，分別經兩樣本作用12 h後，進行細胞基因組DNA 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳. mt 471rhTNFα組的細胞基因組DNA降解成不同倍數的180~200 bp大小的片段，呈現明顯的ladder狀分布（Fig 1）.
2.3流式細胞儀檢測ZR751細胞凋亡與對照組相比，雖然兩實驗組均有凋亡峰出現，但mt 471rhTNFα誘導的凋亡峰面積占43%，wt rhTNFα誘導凋亡峰面積占25%, mt 471rhTNFα誘導的凋亡峰面積高於同濃度wt rhTNFα誘導組，對照組未見凋亡峰.
2.4不同實驗組ZR751中的NFκB活性實驗中，我們選擇了不同的TNFα濃度處理ZR751細胞，實驗結果可知(n=3)當兩型rhTNFα以濃度為10 μg/L作用於ZR751細胞4 h後，與對照組A均值0.6±0.03相比，wt rhTNFα和mt 471rhTNFα處理組的NFκB活化均有增加，其A均值分別為1.35±0.1732和0.9±0.1, wt rhTNFα處理組的NFκB活化增加量高於mt 471rhTNFα處理組（t=7.68, P=0.002）；當兩型TNFα濃度增高到50 μg/L時，wt rhTNFα處理組的增加量明顯增多其A均值為(3.48±0.13)，而mt 471rhTNFα處理組僅有輕度升高，A均值為(1.65±0.217)，兩實驗組間有顯著差異（t=12.49, P=0.000）；當樣品的濃度為100 μg/L時，特別是mt 471rhTNFα處理組的細胞有明顯的死亡，未見到明顯的NFκB活性改變；此外，兩個實驗組均未見到NFκB活化量隨TNFα作用時間的延長而增加， 在一定濃度範圍的TNFα作用下，細胞NFκB的活化有劑量依賴性.
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