馬曉娟 謝有發 余銀芳 李詒光
摘 要：本文旨在探究植物乳桿菌發酵枸杞原漿過程中多糖、活菌數的變化規律，考察枸杞多糖在乳酸菌發酵過程中的代謝情況及枸杞對乳酸菌生長的影響，以期為開發枸杞發酵飲品提供科學依據。枸杞原漿經植物乳桿菌發酵，採用苯酚-硫酸法測定其在發酵過程中的多糖含量，同時採用平板計數法測定發酵過程中植物乳桿菌的活菌數量。結果表明，枸杞多糖在發酵過程中的含量不斷減少，但在發酵終點時仍可達到1271.78mg/L;植物乳桿菌的活菌數在4h之前增長緩慢，4～12h處於對數生長期，活菌數達6.84×109cfu/mL，12h後進入穩定期，28h後開始進入衰亡期，40h時活菌數仍達到2.57×109cfu/mL。
關鍵詞：枸杞原漿 枸杞多糖 植物乳桿菌 活菌數
枸杞是我國傳統的藥食同源性中藥藥材，性甘味平，滋補肝腎、益精明目[1]。枸杞原漿經乳酸菌發酵不僅會產生豐富愉悅的風味而讓消費者更易接受，同時乳酸發酵帶來的益生作用也提高了枸杞的藥用保健價值，為枸杞類飲品市場擴展了更大的開發空間。
枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）是一種水溶性蛋白多糖，其作為枸杞的重要活性成分，主要有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等生理作用[2-4]。中藥材中的一些多糖類物質還具有一定的益生元功能——能夠促進乳酸菌在腸道內的增殖[5-7]，最終達到調節腸道菌群、減少腸道疾病發生的效果。目前，關於酵母發酵枸杞酒或乳酸發酵枸杞果蔬飲品的工藝報道較多，如楊梅枸杞酒[8]、枸杞藍莓酒[9]、石榴枸杞酒[10]等，陳萬更用乳酸菌發酵了枸杞綠茶[11]，徐婧君等用植物乳桿菌發酵果蔬奶（枸杞與胡蘿蔔）[12]。但是，單純以枸杞進行乳酸發酵的案例相對較少，且主要以工藝研究為主。許亮等[13]考察了枸杞果酒發酵過程中多糖先增大、後減小的變化規律，並最終維持在最低水平。本研究以發酵40h的枸杞原漿為檢測樣品，對不同發酵時間的原漿進行枸杞多糖和活菌數的測定，考察枸杞多糖和活菌數在發酵過程中的變化規律，以期為枸杞原漿的乳酸發酵機制提供科學依據。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
枸杞（市售寧夏中寧枸杞）;植物乳桿菌360（Lacto-bacillus plantarum），四川高福記生物科技有限公司;無水葡萄糖（食品級原料），山東保齡寶生物股份有限公司;D-無水葡萄糖（標準品），中國藥品生物製品檢定所;硫酸、苯酚、95%乙醇、NaCl、MRS固體培養基成分等試劑，均為分析純。
1.2 儀器與設備
HM-928料理機，廣州黑馬電器有限公司;電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;HH-4水浴鍋，常州國華電器有限公司;TD5M台式低速離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司;UV-1800紫外-可見分光光度計，SHIMADZU CORPORATION;立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;超凈工作檯，濟南鑫貝西生物技術有限公司;恆溫生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;320 pH Meter，METTLER TOLEDO公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 發酵工藝
1.3.1.1工藝流程
干枸杞→料液比1：6→浸提→打漿（添加5%葡萄糖）→滅菌（105℃、15min）→冷卻、接種（萬分之八）→發酵（37℃、40h）→成品→去籽、調配飲料。
1.3.1.2 工藝要點
原料處理：挑取顆粒均勻、飽滿的枸杞乾果，用水沖洗兩次以去除表面的雜質、灰塵等。
浸泡：以料水比1：6的比例，用溫水（40～50 ℃）浸泡枸杞至變軟。
打漿：將浸泡後的枸杞料液加入5%葡萄糖一起進行打漿、破碎。
滅菌：在105℃下滅菌15min，滅菌時間不能過長，否則會破壞枸杞的色澤。
冷卻：採用自來水及時分段冷卻。
接種：採用植物乳桿菌菌劑進行直投式接種，接種量為原漿重量的萬分之八，將稱好的菌劑溶於少量無菌水後投入原漿中。
發酵：在37℃下發酵40h，定期取樣。
1.3.2 pH值測定
採用pH計進行測定，每隔4h取樣。
1.3.3 多糖測定
採用苯酚-硫酸法[1，14]進行測定，每隔8h取樣。
1.3.3.1 對照品製備
葡萄糖（0.1mg/mL）：準確稱取無水葡萄糖標準品25mg，溶解後置於250mL容量瓶中定容。
1.3.3.2 標準曲線繪製
取標準溶液0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0mL至具塞試管，分別加水定容至2.0mL，然後加1mL5%苯酚溶液，搖勻後加入5mL濃硫酸（H2SO4）搖勻，靜置10min。將具塞試管放入水浴鍋（40℃）保溫15min，迅速冷卻至室溫，放置20min後在490nm下進行紫外吸光度的測定。
1.3.3.3 供試樣品製備
取50mL發酵前後的原漿離心，取上清液3mL，加入30mL95%乙醇，醇沉20min後離心，4000r/min離心20min;棄去上清液，用85%乙醇進行洗滌，最後加水定容至25mL;取200μL樣品測定吸光度。
1.3.3.4 樣品多糖測定
取200 μL樣品溶液至具塞試管，分別加水定容至2.0mL，加5%苯酚溶液1mL，搖勻後加入濃硫酸（H2SO4）5mL再次搖勻，靜置10min;將具塞試管放入水浴鍋（40℃）保溫15min，迅速冷卻至室溫，放置20min;在490nm下進行紫外吸光度的測定。
1.3.4 活菌數測定
採用平板（MRS固體培養基）稀釋法[15]，每隔4h取樣。
1.3.4.1 樣品處理
取發酵枸杞原漿1mL，加入至9mL無菌生理鹽水中，稀釋度為10-1樣液，按此方法依次將枸杞原漿稀釋到10-6、10-7樣液備用。
1.3.4.2乳酸菌計數
取稀釋度為10-6、10-7發酵枸杞原漿1000μL菌液塗布MRS固體培養基上，然後置於37℃恆溫培養箱中培養48h，並記錄單菌落數，同時計算出活菌數。
2 結果與討論
2.1 發酵過程中的pH變化
枸杞原漿在發酵過程中的pH值動態變化如圖1所示。在整個發酵過程中，發酵原漿的整體pH值呈下降趨勢——起始pH值為4.92，在0～8h之間下降不明顯，8～16h之間下降幅度最大，16h之後趨於平緩，發酵終點時pH值達到3.58。究其緣由，主要是因為枸杞原漿中的植物乳桿菌利用自身的酶類物質、通過EMP途徑降解了枸杞原漿中的碳水化合物（如葡萄糖），進而發酵產生了大量有機酸（以乳酸為主），增加了發酵原漿的酸度，降低了pH值。到終點時pH值得變化趨於平緩，主要是由於乳酸菌進入衰亡期，產生的酸有所減少。
2.2 發酵過程中枸杞多糖的含量變化
以D-無水葡萄糖為對照品，以濃度C為縱坐標，吸光度A為橫坐標繪製標準曲線，可得到回歸方程：C=0.0698A-0.0017、R2=0.9991，式中A為吸光度，C為枸杞多糖濃度（mg/L）。枸杞多糖在發酵過程中的動態變化如圖2所示，整個發酵過程中枸杞多糖呈下降趨勢——發酵前多糖含量為2272.25mg/L，發酵終點時達到1271.78mg/L，減少了44.03%。在0～8h之間減速放緩，8～16h之間下降最快，16～40h下降緩慢至趨於平緩，這種趨勢同pH值的下降趨勢基本一致。發酵過程中出現的枸杞多糖變化可能是由於枸杞多糖作為益生元被植物乳桿菌吸收、利用，從而起到了增菌作用[16-17];也可能因為枸杞多糖是一種含少量蛋白質的多糖復合物[18-19]，植物乳桿菌利用枸杞多糖作為碳源或植物乳桿菌產生的酶將其降解[20]，生成了小分子物質，致使多糖含量降低。而在發酵前期，植物乳桿菌優先利用單糖葡萄糖，後期轉為利用多糖。
2.3 發酵過程中乳酸菌的活菌數變化
植物乳桿菌的活菌數在發酵過程中的動態變化如圖3所示，活菌數隨發酵時間的增加先升高後降低，生長趨勢與束文秀等[21]研究中乳酸菌的生長趨勢一致。在0～16h植物乳桿菌的生長速度較快，呈現上升趨勢;4h之前緩慢增長，在12h時接近達到了最高點，活菌數為6.84×109cfu/mL;12～28h時生長平緩，處於穩定期;28h之後下降明顯。究其緣由，主要是由於發酵原漿中碳源等營養物質的減少和代謝產物尤其是酸的產生影響了乳酸菌的生長。整個發酵過程中，活菌數均處於108cfu/mL以上，說明枸杞對植物乳桿菌的生長有促進作用。
3 結論與討論
本研究考察了枸杞原漿在發酵過程中pH值、枸杞多糖和活菌數的變化規律。結果表明，發酵過程中，pH值和枸杞多糖呈現下降趨勢，活菌數先上升後下降，最終pH值達到3.58、枸杞多糖含量達1271.78mg/L、植物乳桿菌活菌數達2.57×109cfu/mL。如果將發酵好的枸杞原漿稀釋100 倍調配成枸杞飲料，其活菌數仍可達到≥106cfu/mL的乳酸菌活菌飲品標準[22]。
本研究中，枸杞多糖減少的結果不同於許亮[13]研究的枸杞果酒中枸杞多糖先增加後減少的結果，這種差別可能由於菌種和發酵條件不同所引起。枸杞多糖的減少反映出植物乳桿菌的代謝對枸杞有一定的作用或影響，其可能被消耗或降解為其他更容易被人體吸收的物質。李越鯤[23]研究的枸杞多糖經超聲波降解LBP-s水溶性增強，體外抗氧化活性高於粗多糖，說明多糖降解後也可以發揮出更好的作用。此外，枸杞多糖也可作為益生元對乳酸菌起到增殖作用。從益生菌對人體有益健康的角度開發產品，在益生菌類產品中添加枸杞多糖等中藥提取物，通過增強益生菌與多糖的協同作用更利於產品的銷售和消費者的青睞。但是發酵過程中枸杞多糖的變化機制和具體原因尚未得出明確結論，需在進一步的研究中進行探討。
參考文獻：
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摘 要：本文旨在探究植物乳桿菌發酵枸杞原漿過程中多糖、活菌數的變化規律，考察枸杞多糖在乳酸菌發酵過程中的代謝情況及枸杞對乳酸菌生長的影響，以期為開發枸杞發酵飲品提供科學依據。枸杞原漿經植物乳桿菌發酵，採用苯酚-硫酸法測定其在發酵過程中的多糖含量，同時採用平板計數法測定發酵過程中植物乳桿菌的活菌數量。結果表明，枸杞多糖在發酵過程中的含量不斷減少，但在發酵終點時仍可達到1271.78mg/L;植物乳桿菌的活菌數在4h之前增長緩慢，4～12h處於對數生長期，活菌數達6.84×109cfu/mL，12h後進入穩定期，28h後開始進入衰亡期，40h時活菌數仍達到2.57×109cfu/mL。
關鍵詞：枸杞原漿 枸杞多糖 植物乳桿菌 活菌數
枸杞是我國傳統的藥食同源性中藥藥材，性甘味平，滋補肝腎、益精明目[1]。枸杞原漿經乳酸菌發酵不僅會產生豐富愉悅的風味而讓消費者更易接受，同時乳酸發酵帶來的益生作用也提高了枸杞的藥用保健價值，為枸杞類飲品市場擴展了更大的開發空間。
枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）是一種水溶性蛋白多糖，其作為枸杞的重要活性成分，主要有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等生理作用[2-4]。中藥材中的一些多糖類物質還具有一定的益生元功能——能夠促進乳酸菌在腸道內的增殖[5-7]，最終達到調節腸道菌群、減少腸道疾病發生的效果。目前，關於酵母發酵枸杞酒或乳酸發酵枸杞果蔬飲品的工藝報道較多，如楊梅枸杞酒[8]、枸杞藍莓酒[9]、石榴枸杞酒[10]等，陳萬更用乳酸菌發酵了枸杞綠茶[11]，徐婧君等用植物乳桿菌發酵果蔬奶（枸杞與胡蘿蔔）[12]。但是，單純以枸杞進行乳酸發酵的案例相對較少，且主要以工藝研究為主。許亮等[13]考察了枸杞果酒發酵過程中多糖先增大、後減小的變化規律，並最終維持在最低水平。本研究以發酵40h的枸杞原漿為檢測樣品，對不同發酵時間的原漿進行枸杞多糖和活菌數的測定，考察枸杞多糖和活菌數在發酵過程中的變化規律，以期為枸杞原漿的乳酸發酵機制提供科學依據。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
枸杞（市售寧夏中寧枸杞）;植物乳桿菌360（Lacto-bacillus plantarum），四川高福記生物科技有限公司;無水葡萄糖（食品級原料），山東保齡寶生物股份有限公司;D-無水葡萄糖（標準品），中國藥品生物製品檢定所;硫酸、苯酚、95%乙醇、NaCl、MRS固體培養基成分等試劑，均為分析純。
1.2 儀器與設備
HM-928料理機，廣州黑馬電器有限公司;電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;HH-4水浴鍋，常州國華電器有限公司;TD5M台式低速離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司;UV-1800紫外-可見分光光度計，SHIMADZU CORPORATION;立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;超凈工作檯，濟南鑫貝西生物技術有限公司;恆溫生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;320 pH Meter，METTLER TOLEDO公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 發酵工藝
1.3.1.1工藝流程
干枸杞→料液比1：6→浸提→打漿（添加5%葡萄糖）→滅菌（105℃、15min）→冷卻、接種（萬分之八）→發酵（37℃、40h）→成品→去籽、調配飲料。
1.3.1.2 工藝要點
原料處理：挑取顆粒均勻、飽滿的枸杞乾果，用水沖洗兩次以去除表面的雜質、灰塵等。
浸泡：以料水比1：6的比例，用溫水（40～50 ℃）浸泡枸杞至變軟。
打漿：將浸泡後的枸杞料液加入5%葡萄糖一起進行打漿、破碎。
滅菌：在105℃下滅菌15min，滅菌時間不能過長，否則會破壞枸杞的色澤。
冷卻：採用自來水及時分段冷卻。
接種：採用植物乳桿菌菌劑進行直投式接種，接種量為原漿重量的萬分之八，將稱好的菌劑溶於少量無菌水後投入原漿中。
發酵：在37℃下發酵40h，定期取樣。
1.3.2 pH值測定
採用pH計進行測定，每隔4h取樣。
1.3.3 多糖測定
採用苯酚-硫酸法[1，14]進行測定，每隔8h取樣。
1.3.3.1 對照品製備
葡萄糖（0.1mg/mL）：準確稱取無水葡萄糖標準品25mg，溶解後置於250mL容量瓶中定容。
1.3.3.2 標準曲線繪製
取標準溶液0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0mL至具塞試管，分別加水定容至2.0mL，然後加1mL5%苯酚溶液，搖勻後加入5mL濃硫酸（H2SO4）搖勻，靜置10min。將具塞試管放入水浴鍋（40℃）保溫15min，迅速冷卻至室溫，放置20min後在490nm下進行紫外吸光度的測定。
1.3.3.3 供試樣品製備
取50mL發酵前後的原漿離心，取上清液3mL，加入30mL95%乙醇，醇沉20min後離心，4000r/min離心20min;棄去上清液，用85%乙醇進行洗滌，最後加水定容至25mL;取200μL樣品測定吸光度。
1.3.3.4 樣品多糖測定
取200 μL樣品溶液至具塞試管，分別加水定容至2.0mL，加5%苯酚溶液1mL，搖勻後加入濃硫酸（H2SO4）5mL再次搖勻，靜置10min;將具塞試管放入水浴鍋（40℃）保溫15min，迅速冷卻至室溫，放置20min;在490nm下進行紫外吸光度的測定。
1.3.4 活菌數測定
採用平板（MRS固體培養基）稀釋法[15]，每隔4h取樣。
1.3.4.1 樣品處理
取發酵枸杞原漿1mL，加入至9mL無菌生理鹽水中，稀釋度為10-1樣液，按此方法依次將枸杞原漿稀釋到10-6、10-7樣液備用。
1.3.4.2乳酸菌計數
取稀釋度為10-6、10-7發酵枸杞原漿1000μL菌液塗布MRS固體培養基上，然後置於37℃恆溫培養箱中培養48h，並記錄單菌落數，同時計算出活菌數。
2 結果與討論
2.1 發酵過程中的pH變化
枸杞原漿在發酵過程中的pH值動態變化如圖1所示。在整個發酵過程中，發酵原漿的整體pH值呈下降趨勢——起始pH值為4.92，在0～8h之間下降不明顯，8～16h之間下降幅度最大，16h之後趨於平緩，發酵終點時pH值達到3.58。究其緣由，主要是因為枸杞原漿中的植物乳桿菌利用自身的酶類物質、通過EMP途徑降解了枸杞原漿中的碳水化合物（如葡萄糖），進而發酵產生了大量有機酸（以乳酸為主），增加了發酵原漿的酸度，降低了pH值。到終點時pH值得變化趨於平緩，主要是由於乳酸菌進入衰亡期，產生的酸有所減少。
2.2 發酵過程中枸杞多糖的含量變化
以D-無水葡萄糖為對照品，以濃度C為縱坐標，吸光度A為橫坐標繪製標準曲線，可得到回歸方程：C=0.0698A-0.0017、R2=0.9991，式中A為吸光度，C為枸杞多糖濃度（mg/L）。枸杞多糖在發酵過程中的動態變化如圖2所示，整個發酵過程中枸杞多糖呈下降趨勢——發酵前多糖含量為2272.25mg/L，發酵終點時達到1271.78mg/L，減少了44.03%。在0～8h之間減速放緩，8～16h之間下降最快，16～40h下降緩慢至趨於平緩，這種趨勢同pH值的下降趨勢基本一致。發酵過程中出現的枸杞多糖變化可能是由於枸杞多糖作為益生元被植物乳桿菌吸收、利用，從而起到了增菌作用[16-17];也可能因為枸杞多糖是一種含少量蛋白質的多糖復合物[18-19]，植物乳桿菌利用枸杞多糖作為碳源或植物乳桿菌產生的酶將其降解[20]，生成了小分子物質，致使多糖含量降低。而在發酵前期，植物乳桿菌優先利用單糖葡萄糖，後期轉為利用多糖。
2.3 發酵過程中乳酸菌的活菌數變化
植物乳桿菌的活菌數在發酵過程中的動態變化如圖3所示，活菌數隨發酵時間的增加先升高後降低，生長趨勢與束文秀等[21]研究中乳酸菌的生長趨勢一致。在0～16h植物乳桿菌的生長速度較快，呈現上升趨勢;4h之前緩慢增長，在12h時接近達到了最高點，活菌數為6.84×109cfu/mL;12～28h時生長平緩，處於穩定期;28h之後下降明顯。究其緣由，主要是由於發酵原漿中碳源等營養物質的減少和代謝產物尤其是酸的產生影響了乳酸菌的生長。整個發酵過程中，活菌數均處於108cfu/mL以上，說明枸杞對植物乳桿菌的生長有促進作用。
3 結論與討論
本研究考察了枸杞原漿在發酵過程中pH值、枸杞多糖和活菌數的變化規律。結果表明，發酵過程中，pH值和枸杞多糖呈現下降趨勢，活菌數先上升後下降，最終pH值達到3.58、枸杞多糖含量達1271.78mg/L、植物乳桿菌活菌數達2.57×109cfu/mL。如果將發酵好的枸杞原漿稀釋100 倍調配成枸杞飲料，其活菌數仍可達到≥106cfu/mL的乳酸菌活菌飲品標準[22]。
本研究中，枸杞多糖減少的結果不同於許亮[13]研究的枸杞果酒中枸杞多糖先增加後減少的結果，這種差別可能由於菌種和發酵條件不同所引起。枸杞多糖的減少反映出植物乳桿菌的代謝對枸杞有一定的作用或影響，其可能被消耗或降解為其他更容易被人體吸收的物質。李越鯤[23]研究的枸杞多糖經超聲波降解LBP-s水溶性增強，體外抗氧化活性高於粗多糖，說明多糖降解後也可以發揮出更好的作用。此外，枸杞多糖也可作為益生元對乳酸菌起到增殖作用。從益生菌對人體有益健康的角度開發產品，在益生菌類產品中添加枸杞多糖等中藥提取物，通過增強益生菌與多糖的協同作用更利於產品的銷售和消費者的青睞。但是發酵過程中枸杞多糖的變化機制和具體原因尚未得出明確結論，需在進一步的研究中進行探討。
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