封曄 FENG Ye
（貴陽職業技術學院，貴陽 550081）
摘要：採用T-RFLP法實驗研究貴州省特有藥用植物根際叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的多樣性。結果表明： 4種貴州省特有藥用植物根際AMF種類豐富，數量較大。植物種類不同，對應的AMF群落多樣性有較大差異，證明了宿主植物對根際微生物群落結構多樣性的影響；同時，有機質、pH和速效磷對根際ＡＭＦ群落多樣性影響較大。
關鍵詞 ：叢枝菌根真菌；貴州特有藥用植物；群落多樣性
中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2015）17-0219-02
作者簡介：封曄（1981-），女，陝西綏德人，貴陽職業技術學院講師，研究方向為微生物應用。
0 引言
貴州特有藥用植物是指目前在貴州省境內發現有分布並具有藥用價值，但是在貴州以外的其它地區都沒有分布的物種，其代表種類有：銀背葉黨參、梵凈山小檗、梵凈山蒲兒根、梵凈山冠唇花、梵凈山火絨草、梵凈山紫苑、短莖淫羊藿等[1]。
菌根真菌（Mycorrhizal fungi）在自然界中有著重要的生態作用，它可以與世界上大多數的維管植物根系形成互惠共生體。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是菌根中分布最廣泛的一類。研究表明，AMF因其能擴大植物根系吸收面積、加快養分運輸速率、分泌活化物質、提高光合速率等直接和間接作用，改善宿主植物的礦質營養，增加植物中的碳積累，進而促進植物生長[2]。
目前對藥用植物AMF的研究主要集中在菌根多樣性或接種菌根真菌對植物的影響。李品明等對重慶市13種中藥材植物的AMF物種多樣性進行了研究，結果表明，從中藥材植物根際土壤中分離出了10種菌根真菌，隸屬三個科[3]。王森等以山西曆山自然保護區暴馬丁香、連香樹、南方紅豆杉和領春木4種珍稀藥用植物為材料，從4種植物根際共鑑定AMF 27種[4]。在國內因藥用植物種質資源豐富，宿主範圍十分廣泛，目前已經對上百種藥用植物進行了研究。
長久以來，中藥材大多來自野生藥用植物，但隨著對藥用植物需求的不斷增加，野生藥用植物已經無法滿足人們對藥用植物的需求，甚至瀕臨滅絕，加之人工栽培技術落後、栽培措施不配套等原因，導致藥用植物種質退化、質量下降、入藥性質不穩定等。本課題主要是通過對貴州特有藥用植物根際土壤採集和分析，研究藥用植物根際AMF種質資源及多樣性，以期為充分發掘和利用AMF資源，篩選AMF優勢菌，利用菌根生物技術提高藥用植物產量、品質和擴大人工栽培區提供材料和依據。
1 材料與方法
1.1 研究地概況
採樣地位於貴州東南部茂蘭保護區及織金縣牛場鎮。本區處於溫暖濕潤的中亞熱帶氣候區，區域內有雷公山和月亮山，分布著適宜常綠櫟林及熱帶常綠闊葉林生長的紅壤和紅黃壤，海拔最高處為2178．8m，最低處137m。區域內有中草藥資源十分豐富。
1.2 樣品採集
2014年10月在貴州省茂蘭保護區及織金縣牛場鎮採集鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、黃連（Coptis chinensis Franch.）、太子參（Pseudostellaria heterophylla(Miq.) Pax）、丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）根系及根際土。每株按東西南北4個方位，除去5cm厚的表層土後，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取帶有細根的根系，用塑膠袋存放根系和根際土樣品。經檢測，土樣基本性質如表1所示。
1.3 AMF的形態觀察及其侵染能力的檢測
採用Philips和Haymay染色方法進行觀察和計算。
1.4 分子生物學方法分析樣品多樣性
1.4.1 總DNA的提取和純化
採用Zhou 等[5]的酶裂解法提取土壤總DNA。
1.4.2 PCR擴增
採用由大連寶生物公司合成的引物AM1 和NS31擴增18SrDNA施測。反應體系為20ml.PCR擴增產物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗。
1.4.3 群落多樣性分析
採用T-RFLP方法分析樣品，以圖譜中每一個限制性片段（T-RF） 為一個OTU，測定OTU數目即為物種豐富度指數（S），峰高值低於100螢光單位的峰不計入分析範疇。根據豐富度指數（S）和相對峰高值（Pi）測定均勻度指數（E） 和Shannon多樣性指數（H）。
相對峰高值（Pi） ：Pi= ni/ N
均勻度指數（E）：E＝H/lnS
Shannon指數（H）：H＝－∑PilnPi
式中，N為該樣品所有累計峰高，ni為第i個T-RF峰值。
1.5 數據分析
用表3中的實驗數據代入EXCEL（2003）、spss（V17.0）軟體系統進行匯總和分析。
2 結果與分析
2.1 根際AMF的形態及其侵染率
從表2中可見，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四種植物中鐵皮石斛的菌根侵染率最高，丹參最低。對比採樣環境可以看出，侵染率與土壤性質有一定相關性。其中pH越高侵染率越高；侵染率與速效磷和速效鉀呈反比。
2.2 群落多樣性
2.2.1 樣品總DNA提取和基因的擴增結果
從土壤中提取出的總DNA粗提樣品中有大量黑褐色雜質，基因組片段大小為20 kb，用1%瓊脂糖電泳檢測，條帶明亮齊整，這說明所得到的微生物總DNA比較完整。擴增的18 SrDNA基因片段長度為550 bp。
2.2.2 群落多樣性指數
表3可見，4個樣品的根際AMF多樣性存在明顯的差異。其中，豐富度指數和Shannon指數最高的是黃連，最低的是太子參，表明植物種類的差異對根際AMF群落多樣性有影響。
3 結論和討論
根際微生物活性及群落結構的變化是評價土壤生態系統的重要指示因子，通過觀察其變化能夠發現植物和土壤質量[6]。本研究表明，4種貴州省特有藥用植物根際AMF種類豐富，數量較大。由於植物種類的不同，AMF群落多樣性也存在很大的差異。由此可見，宿主植物也會影響根際微生物群落結構多樣性。但Oehl具有不同意見，他認為土壤類型和土地利用模式決定了AMF的群落結構[8]。
對於根際微生物來說，很多的環境因子都對其群落多樣性影響很大，如有機質、pH和速效磷等，這是因為土壤微生物中的養分越高，營養物質就越多，這有利於其活性的增加。卜洪震等發現使用肥料後可以促進土壤微生物的活性，並且不同施肥處理對土壤微生物量碳和微生物多樣性有著重要影響[7]。本研究中速效磷是影響AMF群落多樣性的一個主要因素。而從O』Donnell 等[8]學者的研究成果來看，土壤pH值也是一個重要的土壤微生物群落多樣性影響因子。徐輝[9]在現有研究成果的基礎上展開進一步研究，發現速效磷也直接影響刺槐和沙棘根際AMF侵染率。在自然環境中隨著環境因子的變化，土壤微生物群落的形成和變化也會隨之調整，這說明土壤微生物的生長和環境因子有著直接關係。通過研究土壤微生物群落動態變化，也就為了解生態系統的土壤健康狀況和植被發育階段提供了可能。
參考文獻：
[1]孫濟平，何順志.貴州特有藥用植物的種類與分布[J].中國中藥雜誌，2005，30（10）：735-738.
[2]劉潤進，陳應龍.菌根學[M].北京：科技出版社，2007.
[3]李品明，韓如剛，劉傑，等.中藥材植物根際土壤VA菌根多樣性研究[J].湖南農業科學，2011，3：141-142.
[4]王森，唐明，牛振川，等.山西曆山珍稀藥用植物AM真菌資源與土壤因子的關係[J].西北植物學報，2008，28（2）：355-361.
[5]Zhou JZ， Bruns MA， Tiedje JM.DNA recovery from soils of diverse composition. Applied and Environmental Microbiology， 1996，62（2）： 316-322.
[6]滕應，黃昌勇，駱永明，龍健，姚槐應.鉛鋅銀尾礦區土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究.土壤學報，2004，41（1）： 113-119.
[7]卜洪震，王麗宏，尤金成，肖小平，楊光立，胡躍高，曾昭海. 長期施肥管理對紅壤稻田土壤微生物量碳和微生物多樣性的影響.中國農業科學，2010，43（16）：3340-3347.
[8]Oehl F， Laczko E， Bogenrieder A， Stahr K， B?sch R， van der Heijden M， Sieverding E. Soil type and land use intensity determine the composition of arbuscular mycorrhizal fungal communities. Soil Biology and Biochemistry，2010，42（5）：724-738.
[9]徐輝，唐明，高瑞霞.土壤因子對府谷清水川流域砒砂岩區刺槐和沙棘AMF的影響[J].西北植物學報，2008，28（12）：2500-2505.
（貴陽職業技術學院，貴陽 550081）
摘要：採用T-RFLP法實驗研究貴州省特有藥用植物根際叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的多樣性。結果表明： 4種貴州省特有藥用植物根際AMF種類豐富，數量較大。植物種類不同，對應的AMF群落多樣性有較大差異，證明了宿主植物對根際微生物群落結構多樣性的影響；同時，有機質、pH和速效磷對根際ＡＭＦ群落多樣性影響較大。
關鍵詞 ：叢枝菌根真菌；貴州特有藥用植物；群落多樣性
中圖分類號：S567 文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2015）17-0219-02
作者簡介：封曄（1981-），女，陝西綏德人，貴陽職業技術學院講師，研究方向為微生物應用。
0 引言
貴州特有藥用植物是指目前在貴州省境內發現有分布並具有藥用價值，但是在貴州以外的其它地區都沒有分布的物種，其代表種類有：銀背葉黨參、梵凈山小檗、梵凈山蒲兒根、梵凈山冠唇花、梵凈山火絨草、梵凈山紫苑、短莖淫羊藿等[1]。
菌根真菌（Mycorrhizal fungi）在自然界中有著重要的生態作用，它可以與世界上大多數的維管植物根系形成互惠共生體。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是菌根中分布最廣泛的一類。研究表明，AMF因其能擴大植物根系吸收面積、加快養分運輸速率、分泌活化物質、提高光合速率等直接和間接作用，改善宿主植物的礦質營養，增加植物中的碳積累，進而促進植物生長[2]。
目前對藥用植物AMF的研究主要集中在菌根多樣性或接種菌根真菌對植物的影響。李品明等對重慶市13種中藥材植物的AMF物種多樣性進行了研究，結果表明，從中藥材植物根際土壤中分離出了10種菌根真菌，隸屬三個科[3]。王森等以山西曆山自然保護區暴馬丁香、連香樹、南方紅豆杉和領春木4種珍稀藥用植物為材料，從4種植物根際共鑑定AMF 27種[4]。在國內因藥用植物種質資源豐富，宿主範圍十分廣泛，目前已經對上百種藥用植物進行了研究。
長久以來，中藥材大多來自野生藥用植物，但隨著對藥用植物需求的不斷增加，野生藥用植物已經無法滿足人們對藥用植物的需求，甚至瀕臨滅絕，加之人工栽培技術落後、栽培措施不配套等原因，導致藥用植物種質退化、質量下降、入藥性質不穩定等。本課題主要是通過對貴州特有藥用植物根際土壤採集和分析，研究藥用植物根際AMF種質資源及多樣性，以期為充分發掘和利用AMF資源，篩選AMF優勢菌，利用菌根生物技術提高藥用植物產量、品質和擴大人工栽培區提供材料和依據。
1 材料與方法
1.1 研究地概況
採樣地位於貴州東南部茂蘭保護區及織金縣牛場鎮。本區處於溫暖濕潤的中亞熱帶氣候區，區域內有雷公山和月亮山，分布著適宜常綠櫟林及熱帶常綠闊葉林生長的紅壤和紅黃壤，海拔最高處為2178．8m，最低處137m。區域內有中草藥資源十分豐富。
1.2 樣品採集
2014年10月在貴州省茂蘭保護區及織金縣牛場鎮採集鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、黃連（Coptis chinensis Franch.）、太子參（Pseudostellaria heterophylla(Miq.) Pax）、丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）根系及根際土。每株按東西南北4個方位，除去5cm厚的表層土後，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取帶有細根的根系，用塑膠袋存放根系和根際土樣品。經檢測，土樣基本性質如表1所示。
1.3 AMF的形態觀察及其侵染能力的檢測
採用Philips和Haymay染色方法進行觀察和計算。
1.4 分子生物學方法分析樣品多樣性
1.4.1 總DNA的提取和純化
採用Zhou 等[5]的酶裂解法提取土壤總DNA。
1.4.2 PCR擴增
採用由大連寶生物公司合成的引物AM1 和NS31擴增18SrDNA施測。反應體系為20ml.PCR擴增產物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗。
1.4.3 群落多樣性分析
採用T-RFLP方法分析樣品，以圖譜中每一個限制性片段（T-RF） 為一個OTU，測定OTU數目即為物種豐富度指數（S），峰高值低於100螢光單位的峰不計入分析範疇。根據豐富度指數（S）和相對峰高值（Pi）測定均勻度指數（E） 和Shannon多樣性指數（H）。
相對峰高值（Pi） ：Pi= ni/ N
均勻度指數（E）：E＝H/lnS
Shannon指數（H）：H＝－∑PilnPi
式中，N為該樣品所有累計峰高，ni為第i個T-RF峰值。
1.5 數據分析
用表3中的實驗數據代入EXCEL（2003）、spss（V17.0）軟體系統進行匯總和分析。
2 結果與分析
2.1 根際AMF的形態及其侵染率
從表2中可見，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四種植物中鐵皮石斛的菌根侵染率最高，丹參最低。對比採樣環境可以看出，侵染率與土壤性質有一定相關性。其中pH越高侵染率越高；侵染率與速效磷和速效鉀呈反比。
2.2 群落多樣性
2.2.1 樣品總DNA提取和基因的擴增結果
從土壤中提取出的總DNA粗提樣品中有大量黑褐色雜質，基因組片段大小為20 kb，用1%瓊脂糖電泳檢測，條帶明亮齊整，這說明所得到的微生物總DNA比較完整。擴增的18 SrDNA基因片段長度為550 bp。
2.2.2 群落多樣性指數
表3可見，4個樣品的根際AMF多樣性存在明顯的差異。其中，豐富度指數和Shannon指數最高的是黃連，最低的是太子參，表明植物種類的差異對根際AMF群落多樣性有影響。
3 結論和討論
根際微生物活性及群落結構的變化是評價土壤生態系統的重要指示因子，通過觀察其變化能夠發現植物和土壤質量[6]。本研究表明，4種貴州省特有藥用植物根際AMF種類豐富，數量較大。由於植物種類的不同，AMF群落多樣性也存在很大的差異。由此可見，宿主植物也會影響根際微生物群落結構多樣性。但Oehl具有不同意見，他認為土壤類型和土地利用模式決定了AMF的群落結構[8]。
對於根際微生物來說，很多的環境因子都對其群落多樣性影響很大，如有機質、pH和速效磷等，這是因為土壤微生物中的養分越高，營養物質就越多，這有利於其活性的增加。卜洪震等發現使用肥料後可以促進土壤微生物的活性，並且不同施肥處理對土壤微生物量碳和微生物多樣性有著重要影響[7]。本研究中速效磷是影響AMF群落多樣性的一個主要因素。而從O』Donnell 等[8]學者的研究成果來看，土壤pH值也是一個重要的土壤微生物群落多樣性影響因子。徐輝[9]在現有研究成果的基礎上展開進一步研究，發現速效磷也直接影響刺槐和沙棘根際AMF侵染率。在自然環境中隨著環境因子的變化，土壤微生物群落的形成和變化也會隨之調整，這說明土壤微生物的生長和環境因子有著直接關係。通過研究土壤微生物群落動態變化，也就為了解生態系統的土壤健康狀況和植被發育階段提供了可能。
參考文獻：
[1]孫濟平，何順志.貴州特有藥用植物的種類與分布[J].中國中藥雜誌，2005，30（10）：735-738.
[2]劉潤進，陳應龍.菌根學[M].北京：科技出版社，2007.
[3]李品明，韓如剛，劉傑，等.中藥材植物根際土壤VA菌根多樣性研究[J].湖南農業科學，2011，3：141-142.
[4]王森，唐明，牛振川，等.山西曆山珍稀藥用植物AM真菌資源與土壤因子的關係[J].西北植物學報，2008，28（2）：355-361.
[5]Zhou JZ， Bruns MA， Tiedje JM.DNA recovery from soils of diverse composition. Applied and Environmental Microbiology， 1996，62（2）： 316-322.
[6]滕應，黃昌勇，駱永明，龍健，姚槐應.鉛鋅銀尾礦區土壤微生物活性及其群落功能多樣性研究.土壤學報，2004，41（1）： 113-119.
[7]卜洪震，王麗宏，尤金成，肖小平，楊光立，胡躍高，曾昭海. 長期施肥管理對紅壤稻田土壤微生物量碳和微生物多樣性的影響.中國農業科學，2010，43（16）：3340-3347.
[8]Oehl F， Laczko E， Bogenrieder A， Stahr K， B?sch R， van der Heijden M， Sieverding E. Soil type and land use intensity determine the composition of arbuscular mycorrhizal fungal communities. Soil Biology and Biochemistry，2010，42（5）：724-738.
[9]徐輝，唐明，高瑞霞.土壤因子對府谷清水川流域砒砂岩區刺槐和沙棘AMF的影響[J].西北植物學報，2008，28（12）：2500-2505.
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