【關鍵詞】錳;人臍靜脈內皮細胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)
摘要： 目的 探討錳對人臍靜脈內皮細胞系HUVEC-304細胞生長周期及半胱天冬酶3(caspas3)、半胱天冬酶8(caspase8)表達的影響。方法 以100～800μmoml/L)的氯化錳分別處理HUVEC-304細胞24～72h後，四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法檢測EVC-304細胞的生長活性；流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡情況；蛋白印跡法（Western blot）檢測HUVEC-304細胞在，氯化錳半數抑制濃度(IC50)400μmol/L作用24h時caspase8、caspase3的表達。結果 氯化錳可呈時間及劑量依賴性抑制HUVEC-304細胞的增殖和誘導細胞凋亡,抑制率為2234%～9094%，凋亡率為1020%～9873%。氯化錳24hIC50約為400μmol/L，在此濃度下，HUVEC-304細胞caspase8、caspase3表達顯著增高,(P<005)。結論 氯化錳能夠抑制HUVEC-304細胞的增殖，呈明顯的時效和量效關係。caspase8、caspase3表達增高在細胞增殖和凋亡中起重要的作用，可能是其作用機制之一。
關鍵詞： 錳;人臍靜脈內皮細胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)
Effect of manganese on growth of HUVEC-304 cells and expression of caspase
GUO Xiaopeng,HUANG Guoxiang,WU Qing,et al.
Department of Preventive Medicin ,Medical College,Wuhan University of Science and Technology,(Wuhan 430080,China）
Abstract： Objective To investigate the effect of manganese on growth of HUVEC-304 cells and the expression of caspase8、caspase3.Methods HUVEC304 cells were given with various concentrations of MnCl2.The inhibitory ratio was measured by MTT assay.Apoptosis was observed by flow cytometry(FCM).The expression of caspase3 and caspase8 was measured by Western blot.Results MTT results revealed that manganese chloride (from 100 to 800μmol/L) might suppress the proliferation of HUVEC-304 cells(inhibitory ratio were 22.34%～90.94%) and induce apoptosis (apoptosis ratio were 10.20%～98.73%) in dose and time-dependent manner.The result of Western Blot showed that manganese inhibited caspase3 and caspase8 expression (P<0.05).Conclusion Manganese can inhibit proliferation of HUVEC-304 cells with time-and dose-dependent manner.These may be one of important mechanisms that manganese suppressed the proliferation of HUVEC-304 cells and induced apoptosis.
Key words： manganese;HUVEC-304 cells;apoptosis ;caspase3;caspase8
錳可以通過誘導細胞產生不配對的電子自由基形成大量的過氧化物及影響細胞能量代謝等途徑誘導細胞凋亡而發揮毒性作用〔1,2〕,但對細胞凋亡相關基因半胱天冬酶8(caspase8)、半胱天冬酶3(caspase3)及蛋白產物的影響研究較少。本研究通過體外試驗，觀察錳對人臍靜脈內皮細胞系HUVEC-304細胞生長及caspase8、caspase3表達的影響，探討錳誘導細胞凋亡分子機制。
1 材料與方法
11 主要試劑及抗體 氯化錳(天津博迪化工有限公司)，分子量1977,純度>99%,溶解於二甲基亞碸（DMSO），分裝備用。RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清025%的胰酶(中山凌飛公司)；四甲基偶氮噻唑藍(MTT,美國Sigma公司)。caspase3、caspase8一抗為鼠抗人，二抗為羊抗鼠(美國晶美生物工程有限公司)。
12 方法
121 細胞和細胞培養 HUVEC-304細胞株(武漢大學細胞保藏中心)。在含有10%的胎牛血清、青黴素100u/ml及鏈黴素100mg/ml的RPMI-1640培養基中37℃、5%CO2條件下傳代培養。取對數生長期、生長良好、細胞活性大於98%的細胞進行實驗。
122 細胞生長活性檢測 採用MTT比色法，取對數生長期的HUVEC～304細胞進行實驗，將不同濃度的氯化錳100～800μmol/L加入10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640的培養基中，調細胞濃度為5×105/ml，接種於96孔，每種劑量濃度為一組，每個濃度3個平行孔，置37℃、5%CO2培養箱培養不同時間（24，48，72h）後，每孔加20μlMTT，培養4h，棄MTT，每孔加DMSO 150μl，充分溶解。選擇490nm波長，酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值。HUVEC-304細胞的生長抑制率=（1-實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。
123 流式細胞儀檢測細胞凋亡 用螢光素標記的膜聯蛋白V(Annexin-V-FITC)及碘化丙啶（PI）雙標流式細胞儀檢測細胞凋亡，分為不同濃度實驗組及對照組。分別加入終濃度為100～800μmol/L的氯化猛作用24h，用70%乙醇4℃固定2h，磷酸鹽緩衝液(PBS)緩衝液洗3次，離心去上清。用結合緩衝液37℃孵育60min，195μl細胞懸液加5μl Annexin-V-FITC，混勻，室溫10min。用緩衝液洗滌細胞1次，在190μl結合緩衝液中重懸，然後再加10μl20μg/mlPI，流式細胞儀檢測。
124 細胞蛋白質樣品製備及蛋白定量 經處理後的細胞立即棄去培養液,洗滌,離心,加預冷的細胞裂解液(01mol/LNaCl,001mol/LTrisHCl,pH76,0001mol/L乙二胺四醋酸（EDTA）,100μg/ml蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟(PMSF),2μg/mL，亮肽素(Leupeptin) 01ml,裂解30min,然後於10000g離心10min,取上清備用。以
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