作者：陳連水，張浩，袁鳳輝，毛月祥，曹寧，朱茫
【摘要】 目的了解掌握悅目金蛛生活習性和形態特徵，分析毒腺形態與體量的相關性，優化明確制毒路線，獲得較純生理活性較高的蜘蛛粗毒。方法通過毒腺形態解剖，藉助數理統計方法分析了毒腺形態與蜘蛛體量的相關性；採用毒腺解剖法直接獲取性質穩定和最多量的蛛毒粗品，以雞紅細胞為模型檢驗了粗毒效價，探索了毒素離子通道抑制類型。結果毒腺重量與體量呈正相關，按照優化後的製備方法和技術線路，製得5 mg悅目金蛛粗毒；悅目金蛛毒素有促進紅細胞凝集和裂解作用，在鈣離子環境下毒素對紅細胞的裂解作用更強。結論利用毒腺解剖法能夠獲得最大量更高純度的蛛毒，初步確定了蛛毒當中含有凝集素和磷脂酶兩種成分。
【關鍵詞】 悅目金蛛； 毒腺解剖； 粗毒 ； 細胞毒理
ChinaAbstract：ObjectiveHaving a detailed mastery about the Argiope amoena' s morphological characteristics and living habits, we analyzed the relevence of poison gland wEight and length to its body. Using the optimized method we obtained higher biological properties and more pure venom. Methods We got the relevence of poison gland wEIght and length to its body using statistical method by anatoming poison gland. Isolating poison gland from spider, obtained stable and maximum amount of venom， we tested titer of venom and explore the type of inhibit ion channels toxin using chicken red blood cells as a model. Results Venom gland' s weight and body mass were positively correlated. With the optimized mean prepared method, five millingrams of crude venom were got. The venom has effect of promoting red blood cell aggregating and cracking. The blood cell cracked more seriously in the Calcium ions environment. Conclusion More qualified venom can be got by venom gland dissection. We initially know that venom contains phospholipase lectin and agglutinin.
Key words：Argiope amoena; Anatomy of venom; Crude toxin; Cell physiology
蜘蛛是害蟲的重要天敵，以其毒素麻痹殺死獵物。蜘蛛毒素成分複雜，主要為蛋白質和多胺類物質，蛋白質包括各種多肽神經毒素、細胞毒素、酶、激肽類似物、凝集活性肽和抗菌肽等，多胺類物質有ATP、核苷酸、胺基酸、多胺、單胺類等低分子量物質和無機鹽等。蜘蛛毒素具有多種活性，現已證實含有多種特異性多肽配體，可以選擇性地和K+、Na+、 Ca2+ 通道的亞型相結合［1～11］。國內梁宋平等［12］對虎紋捕鳥蛛、海南捕鳥蛛和廣西大疣蛛的毒素進行了較深入的研究。悅目金蛛Argiope amoena隸屬於蜘蛛目園蛛科金蛛屬，體中大型，為結網蜘蛛，在我國南方各省均有分布，多出沒於夏秋季，以卵袋越冬［13］。由於悅目金蛛多生活在植被繁茂的山區，不易飼養，故關於悅目金蛛毒素的研究少有報道。
1 儀器與材料
1.1 儀器
上海精密A1004 電子 天平，Olympus CX41顯微攝像系統，上海新苗DNP-9052BS-Ⅲ電熱恆溫培養箱和DHG-9073BS-Ⅲ恆溫鼓風乾燥箱，湖南星科TGL-16B台式高速離心機，江蘇崑山KQ-50DB數控超聲波清洗器，北京泰克0610-403體式顯微鏡，日本三豐560-108 NK20遊標卡尺，上海光學顯微鏡測微尺和上海亞榮真空抽氣泵與乾燥器等。
1.2 悅目金蛛的採集
悅目金蛛采自於江西省貴溪市冷水林場，共28頭，其中雄性3頭，雌性25頭。悅目金蛛主要分布於山區丘陵地帶，布圓網於向陽面，以捕食較大型昆蟲為主，喜結網於人居區周邊灌叢，尤以牛棚豬圈旁為多。悅目金蛛脆弱，附肢較長，極易損傷，在採集過程當中應格外小心；可以用捕蟲網將蜘蛛捕獲，裝入盒內，放入一些樹葉，以保持濕度和良好通風性，避免振蕩和過度高溫。採集完畢返回後，應將蜘蛛及時放在灌木上實行半開放式生態放養。
2 結果與方法
2.1 悅目金蛛毒腺形態與體量相關性分析
悅目金蛛的毒腺最細端位於螯基前端，並向頭部延伸，多位於頭胸部前段內，覆蓋在神經團上，且左右兩兩相對趨向於蛛體的縱中軸。為了快速、準確而高效地獲得蜘蛛毒腺，避免造成材料的損失，我們對悅目金蛛毒腺進行了形態解剖，明確毒腺的結構和具體位置，然後對毒腺進行形態描述。解剖之前先用電子天平稱出蜘蛛的體重, 對大型個體用遊標卡尺分別量出其頭胸部和腹部的長和寬, 而對小型蜘蛛個體則用顯微測微尺量出其頭胸部和腹部的長和寬，隨後測量取出的毒腺長和寬，並稱重。
具體測量結果見表1～2，對數據進行回歸分析表明：悅目金蛛在性別相同、生境一致、個體大小不同時，蜘蛛毒腺的位置和形態與蜘蛛的種群演化、生活方式和形態體積有一定關係，其中，成蛛的毒腺重量與其體質量之間呈正相關，相關顯著；成體的毒腺長度與其頭胸長之間也為正相關，顯著性檢驗為極顯著。表1 悅目金蛛成體毒腺重量與個體質量的相關性（略）表2 悅目金蛛成體毒腺長度和個體長度的數據相關性分析（略）
2.2 悅目金蛛粗毒提取和製備方法的優化
由於悅目金蛛與特大型虎紋捕鳥蛛、敬釗纓毛蛛等相比，成體相對較小，含毒量不多，且附肢長，給采毒帶來困難；我們在嘗試過活體誘導取毒、電刺激取毒和解剖分離毒腺等多種方法後，確定了採用毒腺解剖法，後經多次比對試驗，優化出一條適於毒量不大蜘蛛毒腺的解剖勻漿取毒法，步驟如下：
先將蜘蛛放入冰箱-4℃凍暈，根據鰲肢確定毒腺管位置，然後從背面「丁字型」剪開其頭胸甲，依毒腺管向上延伸方向找到毒腺，並用鑷子小心取出，將其冰凍乾燥保存。
取15對乾燥毒腺，在2～3倍去離子水中製成勻漿，用2 000 r/min的速率離心15 min，取上清液。向沉澱物中加等體積去離子水，再離心，取上清液。再向沉澱物中加等體積去離子水，調pH 值至4.0，勻漿、離心、取上清液，合併上清液，過濾，去除雜質，得到澄清液，進行冷凍，等結成冰塊，將冷凍的蛛毒冰塊放置於真空乾燥器內，進行真空乾燥，在乾燥器的底層放適量的氧化鈣作為乾燥劑，接著用真空泵抽氣，抽氣過程中，要注意觀察，如果發現蛛毒表面產生大量氣泡時，就要停止片刻再抽，直至基本乾燥，變成大小不等的顆粒結晶體為止，真空乾燥一般在6 h內徹底乾燥完。乾燥後的蛛毒即成粉末狀或塊狀，刮下干毒粉分裝成小瓶，溶蠟密封，貼上標籤，註明蛛毒毒粉的製備日期和重量，上包不透明的黑紙，置於-５℃的冰箱內可保存1年不變質。在整個取毒和製備過程中，應首先注意整個過程必須潔凈衛生，確保采毒的純度，其次取毒過程儘量在低溫下進行，各種試劑必須預先冰浴。
2.3 悅目金蛛粗毒組分和效價檢測
2.3.1 悅目金蛛粗毒組分及結構觀察
常溫下，提取製備到的悅目金蛛粗毒呈粉狀；用光學顯微鏡觀察粗毒，100和400倍下粗毒呈片狀或片狀均勻晶體，不含其它顆粒雜質。見圖1。
轉貼於論文聯盟 http://www.lwlm.com
【摘要】 目的了解掌握悅目金蛛生活習性和形態特徵，分析毒腺形態與體量的相關性，優化明確制毒路線，獲得較純生理活性較高的蜘蛛粗毒。方法通過毒腺形態解剖，藉助數理統計方法分析了毒腺形態與蜘蛛體量的相關性；採用毒腺解剖法直接獲取性質穩定和最多量的蛛毒粗品，以雞紅細胞為模型檢驗了粗毒效價，探索了毒素離子通道抑制類型。結果毒腺重量與體量呈正相關，按照優化後的製備方法和技術線路，製得5 mg悅目金蛛粗毒；悅目金蛛毒素有促進紅細胞凝集和裂解作用，在鈣離子環境下毒素對紅細胞的裂解作用更強。結論利用毒腺解剖法能夠獲得最大量更高純度的蛛毒，初步確定了蛛毒當中含有凝集素和磷脂酶兩種成分。
【關鍵詞】 悅目金蛛； 毒腺解剖； 粗毒 ； 細胞毒理
ChinaAbstract：ObjectiveHaving a detailed mastery about the Argiope amoena' s morphological characteristics and living habits, we analyzed the relevence of poison gland wEight and length to its body. Using the optimized method we obtained higher biological properties and more pure venom. Methods We got the relevence of poison gland wEIght and length to its body using statistical method by anatoming poison gland. Isolating poison gland from spider, obtained stable and maximum amount of venom， we tested titer of venom and explore the type of inhibit ion channels toxin using chicken red blood cells as a model. Results Venom gland' s weight and body mass were positively correlated. With the optimized mean prepared method, five millingrams of crude venom were got. The venom has effect of promoting red blood cell aggregating and cracking. The blood cell cracked more seriously in the Calcium ions environment. Conclusion More qualified venom can be got by venom gland dissection. We initially know that venom contains phospholipase lectin and agglutinin.
Key words：Argiope amoena; Anatomy of venom; Crude toxin; Cell physiology
蜘蛛是害蟲的重要天敵，以其毒素麻痹殺死獵物。蜘蛛毒素成分複雜，主要為蛋白質和多胺類物質，蛋白質包括各種多肽神經毒素、細胞毒素、酶、激肽類似物、凝集活性肽和抗菌肽等，多胺類物質有ATP、核苷酸、胺基酸、多胺、單胺類等低分子量物質和無機鹽等。蜘蛛毒素具有多種活性，現已證實含有多種特異性多肽配體，可以選擇性地和K+、Na+、 Ca2+ 通道的亞型相結合［1～11］。國內梁宋平等［12］對虎紋捕鳥蛛、海南捕鳥蛛和廣西大疣蛛的毒素進行了較深入的研究。悅目金蛛Argiope amoena隸屬於蜘蛛目園蛛科金蛛屬，體中大型，為結網蜘蛛，在我國南方各省均有分布，多出沒於夏秋季，以卵袋越冬［13］。由於悅目金蛛多生活在植被繁茂的山區，不易飼養，故關於悅目金蛛毒素的研究少有報道。
1 儀器與材料
1.1 儀器
上海精密A1004 電子 天平，Olympus CX41顯微攝像系統，上海新苗DNP-9052BS-Ⅲ電熱恆溫培養箱和DHG-9073BS-Ⅲ恆溫鼓風乾燥箱，湖南星科TGL-16B台式高速離心機，江蘇崑山KQ-50DB數控超聲波清洗器，北京泰克0610-403體式顯微鏡，日本三豐560-108 NK20遊標卡尺，上海光學顯微鏡測微尺和上海亞榮真空抽氣泵與乾燥器等。
1.2 悅目金蛛的採集
悅目金蛛采自於江西省貴溪市冷水林場，共28頭，其中雄性3頭，雌性25頭。悅目金蛛主要分布於山區丘陵地帶，布圓網於向陽面，以捕食較大型昆蟲為主，喜結網於人居區周邊灌叢，尤以牛棚豬圈旁為多。悅目金蛛脆弱，附肢較長，極易損傷，在採集過程當中應格外小心；可以用捕蟲網將蜘蛛捕獲，裝入盒內，放入一些樹葉，以保持濕度和良好通風性，避免振蕩和過度高溫。採集完畢返回後，應將蜘蛛及時放在灌木上實行半開放式生態放養。
2 結果與方法
2.1 悅目金蛛毒腺形態與體量相關性分析
悅目金蛛的毒腺最細端位於螯基前端，並向頭部延伸，多位於頭胸部前段內，覆蓋在神經團上，且左右兩兩相對趨向於蛛體的縱中軸。為了快速、準確而高效地獲得蜘蛛毒腺，避免造成材料的損失，我們對悅目金蛛毒腺進行了形態解剖，明確毒腺的結構和具體位置，然後對毒腺進行形態描述。解剖之前先用電子天平稱出蜘蛛的體重, 對大型個體用遊標卡尺分別量出其頭胸部和腹部的長和寬, 而對小型蜘蛛個體則用顯微測微尺量出其頭胸部和腹部的長和寬，隨後測量取出的毒腺長和寬，並稱重。
具體測量結果見表1～2，對數據進行回歸分析表明：悅目金蛛在性別相同、生境一致、個體大小不同時，蜘蛛毒腺的位置和形態與蜘蛛的種群演化、生活方式和形態體積有一定關係，其中，成蛛的毒腺重量與其體質量之間呈正相關，相關顯著；成體的毒腺長度與其頭胸長之間也為正相關，顯著性檢驗為極顯著。表1 悅目金蛛成體毒腺重量與個體質量的相關性（略）表2 悅目金蛛成體毒腺長度和個體長度的數據相關性分析（略）
2.2 悅目金蛛粗毒提取和製備方法的優化
由於悅目金蛛與特大型虎紋捕鳥蛛、敬釗纓毛蛛等相比，成體相對較小，含毒量不多，且附肢長，給采毒帶來困難；我們在嘗試過活體誘導取毒、電刺激取毒和解剖分離毒腺等多種方法後，確定了採用毒腺解剖法，後經多次比對試驗，優化出一條適於毒量不大蜘蛛毒腺的解剖勻漿取毒法，步驟如下：
先將蜘蛛放入冰箱-4℃凍暈，根據鰲肢確定毒腺管位置，然後從背面「丁字型」剪開其頭胸甲，依毒腺管向上延伸方向找到毒腺，並用鑷子小心取出，將其冰凍乾燥保存。
取15對乾燥毒腺，在2～3倍去離子水中製成勻漿，用2 000 r/min的速率離心15 min，取上清液。向沉澱物中加等體積去離子水，再離心，取上清液。再向沉澱物中加等體積去離子水，調pH 值至4.0，勻漿、離心、取上清液，合併上清液，過濾，去除雜質，得到澄清液，進行冷凍，等結成冰塊，將冷凍的蛛毒冰塊放置於真空乾燥器內，進行真空乾燥，在乾燥器的底層放適量的氧化鈣作為乾燥劑，接著用真空泵抽氣，抽氣過程中，要注意觀察，如果發現蛛毒表面產生大量氣泡時，就要停止片刻再抽，直至基本乾燥，變成大小不等的顆粒結晶體為止，真空乾燥一般在6 h內徹底乾燥完。乾燥後的蛛毒即成粉末狀或塊狀，刮下干毒粉分裝成小瓶，溶蠟密封，貼上標籤，註明蛛毒毒粉的製備日期和重量，上包不透明的黑紙，置於-５℃的冰箱內可保存1年不變質。在整個取毒和製備過程中，應首先注意整個過程必須潔凈衛生，確保采毒的純度，其次取毒過程儘量在低溫下進行，各種試劑必須預先冰浴。
2.3 悅目金蛛粗毒組分和效價檢測
2.3.1 悅目金蛛粗毒組分及結構觀察
常溫下，提取製備到的悅目金蛛粗毒呈粉狀；用光學顯微鏡觀察粗毒，100和400倍下粗毒呈片狀或片狀均勻晶體，不含其它顆粒雜質。見圖1。
轉貼於論文聯盟 http://www.lwlm.com
收藏