作者：曾祥鳳，曾耀英, 李海仙，林長樂，趙令齋，李莉平，肇靜嫻
【關鍵詞】穿琥寧粉針劑；愛滋病病毒；細胞融合；鈣黃綠素
AntiHIV1 effect in vitro of Chuanhuning injection
【Abstract】 AIM: To investigate the inhibitory effect of Chuanhuning (CHN) injection on human immunodeficiency virus type 1 (HIV1) infection in vitro. METHODS: CalcEinAM stained H9/HIV1ⅢB cells were treated with serially diluted CHN injection, then cocultured with target cells MT2, and HIV1mediated cell fusion was observed under a fluorescent microscope. The protective effect of CHN on HIV1infected cells was determined by MTT. Viral replication was evaluated by measuring the level of p24 antigen in culture supernatants by ELISA. RESULTS: CHN injection could suppress the fusion of MT2 and H9/HIV1ⅢB cells （EC50: 5.49 mg/L，SI: 327.6）, thus protecting HIV1 infected cells from death （EC50: 64.57 mg/L，SI: 27.85）， and decreasing p24 antigen release (EC50: 194.67 mg/L，SI: 9.23）. CONCLUSION: CHN injection can inhibit HIV1 infection in vitro.
【Keywords】 ChuanHuNing; HIV1; cell fusion; Calcien AM
【摘要】 目的: 探討穿琥寧粉針劑在體外是否具有抗HIV作用. 方法 ：採用螢光染料Calcien AM標記HIV感染的慢性H9細胞（H9/HIV1ⅢB）與不同稀釋濃度的穿琥寧藥物作用後，與靶細胞MT2細胞混合培養，觀察MT2和H9/HIV1ⅢB融合細胞的變化；MTT法檢測穿琥寧對HIV感染細胞的保護作用；HIV1P24抗原試劑盒檢測藥物作用後的細胞培養上清P24抗原含量的變化. 結果：穿琥寧粉針劑能夠抑制MT2和H9/HIV1ⅢB細胞融合（其抑制融合的EC50為5.49 mg/L，選擇指數SI為327.6）；能夠保護HIV感染細胞的死亡（EC50為64.57 mg/L，SI為27.85）和減少HIV1 P24抗原的表達（EC50為194.67 mg/L，SI為9.23）. 結論：穿琥寧粉針劑在體外具有抗HIV1的作用.
【關鍵詞】 穿琥寧粉針劑；愛滋病病毒；細胞融合；鈣黃綠素
0引言
隨著我國人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV) 感染流行形勢的日益嚴重，臨床就診的HIV感染者/AIDS（acquired immunodeficiency syndrome）患者在逐步增多，臨床 治療 的壓力越來越大［1］. 但由於我國治療愛滋病的藥物開發及研製工作滯後，故 目前 尚無療效可靠， 經濟 實用的藥物. 雖然世界上有公認的治療愛滋病有效的高效抗逆轉錄酶病毒聯合療法(highly active antiretroviral therapy，HAART)，由於價格昂貴且副作用極大［2-3］，難為我國患者廣泛接受並長期 應用 . 因此， 研究 和開發有效的傳統中藥防治愛滋病非常重要.
穿琥寧是從穿心蓮葉中提取的一種純中藥製劑，屬於一種低毒高效的抗病毒藥. 具有抗炎、抗病毒及清熱解毒的作用，臨床已廣泛用於感染性疾病的治療,尤其對病毒性疾病有較好的療效［4-5］. 但穿琥寧對HIV/AIDS的作用報道很少, 本研究用不同濃度的穿琥寧和H9/HIV1ⅢB作用觀察其是否具有抗HIV1的作用.
1材料和方法
1.1材料中藥穿琥寧粉針劑（哈爾濱二聯藥業有限公司）用PBS配製為100 g/L存儲液，無菌分裝，-20℃貯存備用. AZT（疊氮胸苷）(3′ Azido3′deoxythymidine)（美國 Biochemika Fluka） 100 mg，用二甲亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)配成100 g/L ，分裝-20℃貯存備用. 藥物存儲液於實驗前用RPMI1640培養基按需要稀釋至所需工作濃度. 鈣黃綠素（CalceinAM，美國 Molecular Probes），用DMSO溶解配製成1 mmol/L，分裝，-20℃貯存備用. 噻唑藍(MTT, Sigma) PBS配製5 g/L，-20℃貯存備用. P24抗原檢測試劑盒（美國 ZeptoMetrix）. RPMI1640培養液(美國Gibco), 配製時加入青黴素1×105 U/L, 鏈黴素100 mg/L, 過濾除菌，使用時加入100 mL/L (V/V)胎牛血清（FBS）. HIV1ⅢB感染的慢性H9細胞（H9/HIV1ⅢB）和MT2細胞來自美國，由南方醫科大學免疫教研室惠贈.
1.2方法
1.2.1細胞和病毒培養H9/HIV1ⅢB細胞和MT2細胞用含100 mL/L (V/V)FBS的RPMI1640培養基在37℃，50 mL/L CO2培養箱培養，2～3 d傳代1次. 進行藥物實驗前1 d再傳代換液1次使細胞處於對數生長期.
1.2.2穿琥寧對細胞的毒性測定採用MTT法［6］分別測定穿琥寧對MT2細胞和H9/HIV1ⅢB細胞毒性. 觀察細胞存活率和求出CC50濃度（50% cytotoxic concentration，即對50%宿主細胞產生細胞毒作用時的藥物濃度）. 細胞存活率=(實驗組A均值/對照組A均值)×100%）. 根據細胞存活率按照ReedMuench法求出CC50濃度.
1.2.3藥物對H9/HIV1ⅢB細胞與MT2細胞早期融合的 影響 ① H9/HIV1ⅢB細胞用分子螢光探針CalceinAM螢光染色：收集對數生長期的H9/HIV1ⅢB細胞，計數並配製4×108/L細胞懸液. 按1 mL H9/HIV1ⅢB細胞加入2.5 μL 1 mmol/L CalceinAM. 37℃孵育30 min. PBS洗滌2次，再用含100 mL/L FBS的RPMI1640培養液重懸細胞，再計數並調整細胞濃度為4×108/L. ② H9/HIV1ⅢB細胞和藥物作用：將CalceinAM標記的H9/HIV1ⅢB細胞加到96孔板，每孔25 μL細胞懸液. 然後分別加入不同稀釋度穿琥寧藥物25 μL，為實驗組，另外設不加藥物的病毒對照組，和加AZT藥物陽性對照組. 每種樣本設3個復孔. 37℃孵育30 min. ③ 細胞融合：每孔加入50 μL處於對數生長期的MT2細胞（細胞濃度2×109/L），同時設單獨的MT2細胞對照（正常細胞對照）. 37℃孵育2 h. 在倒置螢光顯微鏡下觀察細胞的融合，每孔隨機計數4個視野，取均值. 重複實驗3次. 計數不同稀釋度藥物的融合細胞數，並 計算 出融合細胞均數(N)值. 融合抑制率(%)=（1-實驗組N值/對照組N值）×100. 根據融合抑制率按照ReedMuench法算出EC50 (50% effective concentration，為抑制合胞體形成達50%時的藥物濃度). 選擇指數(selectivity index, SI)為CC50/EC50的比值.
【關鍵詞】穿琥寧粉針劑；愛滋病病毒；細胞融合；鈣黃綠素
AntiHIV1 effect in vitro of Chuanhuning injection
【Abstract】 AIM: To investigate the inhibitory effect of Chuanhuning (CHN) injection on human immunodeficiency virus type 1 (HIV1) infection in vitro. METHODS: CalcEinAM stained H9/HIV1ⅢB cells were treated with serially diluted CHN injection, then cocultured with target cells MT2, and HIV1mediated cell fusion was observed under a fluorescent microscope. The protective effect of CHN on HIV1infected cells was determined by MTT. Viral replication was evaluated by measuring the level of p24 antigen in culture supernatants by ELISA. RESULTS: CHN injection could suppress the fusion of MT2 and H9/HIV1ⅢB cells （EC50: 5.49 mg/L，SI: 327.6）, thus protecting HIV1 infected cells from death （EC50: 64.57 mg/L，SI: 27.85）， and decreasing p24 antigen release (EC50: 194.67 mg/L，SI: 9.23）. CONCLUSION: CHN injection can inhibit HIV1 infection in vitro.
【Keywords】 ChuanHuNing; HIV1; cell fusion; Calcien AM
【摘要】 目的: 探討穿琥寧粉針劑在體外是否具有抗HIV作用. 方法 ：採用螢光染料Calcien AM標記HIV感染的慢性H9細胞（H9/HIV1ⅢB）與不同稀釋濃度的穿琥寧藥物作用後，與靶細胞MT2細胞混合培養，觀察MT2和H9/HIV1ⅢB融合細胞的變化；MTT法檢測穿琥寧對HIV感染細胞的保護作用；HIV1P24抗原試劑盒檢測藥物作用後的細胞培養上清P24抗原含量的變化. 結果：穿琥寧粉針劑能夠抑制MT2和H9/HIV1ⅢB細胞融合（其抑制融合的EC50為5.49 mg/L，選擇指數SI為327.6）；能夠保護HIV感染細胞的死亡（EC50為64.57 mg/L，SI為27.85）和減少HIV1 P24抗原的表達（EC50為194.67 mg/L，SI為9.23）. 結論：穿琥寧粉針劑在體外具有抗HIV1的作用.
【關鍵詞】 穿琥寧粉針劑；愛滋病病毒；細胞融合；鈣黃綠素
0引言
隨著我國人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV) 感染流行形勢的日益嚴重，臨床就診的HIV感染者/AIDS（acquired immunodeficiency syndrome）患者在逐步增多，臨床 治療 的壓力越來越大［1］. 但由於我國治療愛滋病的藥物開發及研製工作滯後，故 目前 尚無療效可靠， 經濟 實用的藥物. 雖然世界上有公認的治療愛滋病有效的高效抗逆轉錄酶病毒聯合療法(highly active antiretroviral therapy，HAART)，由於價格昂貴且副作用極大［2-3］，難為我國患者廣泛接受並長期 應用 . 因此， 研究 和開發有效的傳統中藥防治愛滋病非常重要.
穿琥寧是從穿心蓮葉中提取的一種純中藥製劑，屬於一種低毒高效的抗病毒藥. 具有抗炎、抗病毒及清熱解毒的作用，臨床已廣泛用於感染性疾病的治療,尤其對病毒性疾病有較好的療效［4-5］. 但穿琥寧對HIV/AIDS的作用報道很少, 本研究用不同濃度的穿琥寧和H9/HIV1ⅢB作用觀察其是否具有抗HIV1的作用.
1材料和方法
1.1材料中藥穿琥寧粉針劑（哈爾濱二聯藥業有限公司）用PBS配製為100 g/L存儲液，無菌分裝，-20℃貯存備用. AZT（疊氮胸苷）(3′ Azido3′deoxythymidine)（美國 Biochemika Fluka） 100 mg，用二甲亞碸(dimethyl sulfoxide, DMSO)配成100 g/L ，分裝-20℃貯存備用. 藥物存儲液於實驗前用RPMI1640培養基按需要稀釋至所需工作濃度. 鈣黃綠素（CalceinAM，美國 Molecular Probes），用DMSO溶解配製成1 mmol/L，分裝，-20℃貯存備用. 噻唑藍(MTT, Sigma) PBS配製5 g/L，-20℃貯存備用. P24抗原檢測試劑盒（美國 ZeptoMetrix）. RPMI1640培養液(美國Gibco), 配製時加入青黴素1×105 U/L, 鏈黴素100 mg/L, 過濾除菌，使用時加入100 mL/L (V/V)胎牛血清（FBS）. HIV1ⅢB感染的慢性H9細胞（H9/HIV1ⅢB）和MT2細胞來自美國，由南方醫科大學免疫教研室惠贈.
1.2方法
1.2.1細胞和病毒培養H9/HIV1ⅢB細胞和MT2細胞用含100 mL/L (V/V)FBS的RPMI1640培養基在37℃，50 mL/L CO2培養箱培養，2～3 d傳代1次. 進行藥物實驗前1 d再傳代換液1次使細胞處於對數生長期.
1.2.2穿琥寧對細胞的毒性測定採用MTT法［6］分別測定穿琥寧對MT2細胞和H9/HIV1ⅢB細胞毒性. 觀察細胞存活率和求出CC50濃度（50% cytotoxic concentration，即對50%宿主細胞產生細胞毒作用時的藥物濃度）. 細胞存活率=(實驗組A均值/對照組A均值)×100%）. 根據細胞存活率按照ReedMuench法求出CC50濃度.
1.2.3藥物對H9/HIV1ⅢB細胞與MT2細胞早期融合的 影響 ① H9/HIV1ⅢB細胞用分子螢光探針CalceinAM螢光染色：收集對數生長期的H9/HIV1ⅢB細胞，計數並配製4×108/L細胞懸液. 按1 mL H9/HIV1ⅢB細胞加入2.5 μL 1 mmol/L CalceinAM. 37℃孵育30 min. PBS洗滌2次，再用含100 mL/L FBS的RPMI1640培養液重懸細胞，再計數並調整細胞濃度為4×108/L. ② H9/HIV1ⅢB細胞和藥物作用：將CalceinAM標記的H9/HIV1ⅢB細胞加到96孔板，每孔25 μL細胞懸液. 然後分別加入不同稀釋度穿琥寧藥物25 μL，為實驗組，另外設不加藥物的病毒對照組，和加AZT藥物陽性對照組. 每種樣本設3個復孔. 37℃孵育30 min. ③ 細胞融合：每孔加入50 μL處於對數生長期的MT2細胞（細胞濃度2×109/L），同時設單獨的MT2細胞對照（正常細胞對照）. 37℃孵育2 h. 在倒置螢光顯微鏡下觀察細胞的融合，每孔隨機計數4個視野，取均值. 重複實驗3次. 計數不同稀釋度藥物的融合細胞數，並 計算 出融合細胞均數(N)值. 融合抑制率(%)=（1-實驗組N值/對照組N值）×100. 根據融合抑制率按照ReedMuench法算出EC50 (50% effective concentration，為抑制合胞體形成達50%時的藥物濃度). 選擇指數(selectivity index, SI)為CC50/EC50的比值.