作者：馬軍，郭敏，李印，唐芙愛，虎建恩，段芳齡
【關鍵詞】食管腫瘤；癌,鱗狀細胞；轉化生長因子β;,,endoglin；新生血管化,病理性
【Abstract】 AIM: To investigate the expressions of TGFβ and Endoglin/CD105 in esophageal carcinoma from patients in high incidence area in north China. METHODS: The expressions of TGFβ and Endoglin/CD105 mRNA and protEin were detected in 30 esophageal carcinoma samples using RNase protection assay and immunohistochemical staining. RESULTS: TGFβ1, TGFβ3 and Endoglin/CD105 mRNA, other than TGFβ2, were significantly increased in esophageal carcinoma than those of adjacent noncancerous tissue(P<0.05). There was a significant correlation between TGFβ3 and Endoglin/CD105 at mRNA level. CONCLUSION: The overexpressions of TGFβ1, TGFβ3 and Endoglin/CD105 may be involved in the regulation of angiogenesis in esophageal carcinoma. Endoglin/CD105 is an important angiogenesis marker as well as regulatory component on cell membrane in regulating the biological function of TGFβ. Endoglin/CD105 could be a potential target to antiangiogenesis therapy.
【Keywords】 esophageal neoplasms; carcinoma, squamous cell; transforming growth factor beta; endoglin; neovascularization, pathologic
【摘要】目的： 研究 食管鱗癌中TGFβ和Endoglin/CD105的表達及在血管生成中的作用. 方法 ： 採用RNA酶保護性 分析 和免疫組織化學方法對30例食管癌高發區食管癌患者的癌組織和癌旁組織TGFβ和Endoglin/CD105 mRNA和蛋白表達水平進行檢測. 結果： 食管癌組織中TGFβ1和TGFβ3 mRNA較癌旁組織顯著增高(P＜0.05)，TGFβ2無變化. 食管癌組織中Endoglin/CD105 mRNA較癌旁組織也顯著升高(P＜0.05). TGFβ3 mRNA與Endoglin/CD105 mRNA的相關分析顯示有相關關係. 結論： TGFβ和Endoglin/CD105參與了食管鱗癌血管生成過程的調節， Endoglin/CD105不僅是細胞膜上TGFβ受體中調節TGFβ生物學功能的一個重要分子，而且是新生血管的重要標誌. 因此調節Endoglin/CD105的功能可能成為抗血管 治療 中的一個潛在的、具有較寬生物防治譜的靶點.
【關鍵詞】食管腫瘤；癌，鱗狀細胞；轉化生長因子β; endoglin；新生血管化，病理性
TGFβ是一類多功能細胞因子，參與多種細胞功能的調節，包括細胞增殖、分化、遷移、細胞外基質的合成等［1］. TGFβ是Mr 25 000的二聚體，哺乳動物細胞中包括三種亞型： TGFβ1， TGFβ2， TGFβ3. TGFβ1在細胞生長過程中的作用較為複雜，研究顯示在不同細胞類型和/或不同階段可促進或抑制細胞生長［2］, 在多種（尤其是上皮源性）非惡性細胞中，它通過誘導細胞凋亡和/或通過上調細胞周期依賴抑制因子（p15，p21和p27）的水平將細胞阻滯在G1期從而抑制細胞的生長［2-4］. 由於惡性腫瘤細胞常存在TGFβ受體的丟失、突變和/或缺陷而對TGFβ1生長抑制作用產生抗性［2］，此外，TGFβ1可通過刺激腫瘤血管生成，細胞外基質重塑及抑制機體對腫瘤細胞的免疫反應等多種途徑促進腫瘤的生長［2,5］. 本研究對食管癌高發區食管癌患者癌組織中TGFβ和其受體調節分子Endoglin mRNA 進行檢測並探討其在血管生成中的作用.
1對象和方法
1.1對象30例食管癌標本來自食管癌高發區河南省林州市人民 醫院 199903~05間手術患者. 術中切除的食管癌標本迅速放入液氮中儲存備用. 其中男17例，女13例，年齡43~71（平均56±9）歲. 病 理學 檢查均為食管鱗狀上皮細胞癌，其中高中分化20例，低分化10例.
1.2方法
1.2.1RNA提取和多探針RNA酶保護性分析根據以往描述的方法［6］，對食管癌標本進行多部位取材，在低溫下研碎後採用Trireagent（美國MRC公司產品）提取總RNA，分光光度計（PharmaciaBiotech）檢測RNA濃度，以30 μg分裝備用. 採用多探針RNA酶保護性分析試劑盒（美國Pharmingen產品），以hck3為多探針模板（包括TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3）根據產品說明進行操作. 採用Cyclone Phosphorimager（美國HP公司產品）對mRNA表達進行定量分析. 看家基因L32作為內參照以確定RNA的上樣量，每例標本儘量重複多次，以減少誤差，部分標本因為RNA量不足，只做1次，如圖1中病例8的癌旁組織和病例9的癌組織.
1.2.2腫瘤組織中血管的組織化學染色及定量分析食管癌CD105 免疫組織化學染色及定量分析採用Fenton 等［7］的方法. ① 冰凍組織切片:新鮮標本用OCT 包埋後,4~5 μm 連續切片,儘量避開出血壞死區. 30 例新鮮組織冰凍切片後,丙酮固定10 min,空氣中乾燥10min後備用. ② 血管的組織化學染色(CD105) 方法: PBS洗10 min×1 , 5 min×1; 50 mL/L正常血清封閉30 min，PBS 洗5 min×3; 30 mL/L雙氧水5 min, PBS 洗5 min×3; CD105 (1∶100) 孵育過夜; PBS 洗5 min×3; HRP 標記的羊抗兔抗體(1∶25) 孵育1 h, PBS 洗 5 min×3; AEC顯色40 min，置於PBS 中. ③ 腫瘤血管的定量分析:在顯微鏡下採用SONY自動數碼成像系統(3CCD型) 對每一例腫瘤組織隨機選取起始點連續採集16個200×高倍視野形成一張完整腫瘤血管圖片(總面積為1514 mm2) 用於定量分析. 採用商用Imageproplus 軟體對血管進行定量分析,其原理為 計算 機隨機選取多個點以測量隨機點與血管的平均距離(以μm為單位) ,因此血管平均距離越小,血管密度越高.
統計學處理： 數據以x±s表示，使用SPSS10.0軟體進行統計分析，食管癌組織及癌旁組織mRNA分析採用配對資料t檢驗，相關分析採用直線相關分析計算相關係數，檢驗採用Pearson檢驗. P<0.05為有統計學意義.
2結果
2.1TGFβ mRNA表達水平檢測TGFβ mRNA表達水平見圖1，其量化結果見表1. 其中TGFβ1，TGFβ3在食管癌組織中的mRNA較癌旁組織明顯增高（P＜0.05）, TGFβ2與癌旁組織中相比無變化.
圖1RNA酶保護試驗檢測食管鱗癌和癌旁組織轉化生長因子mRNA表達情況
圖1中顯示病例69的TGFβ1, β2, β3的mRNA表達，N表示癌旁組織，T表示腫瘤組織，定量分析以L32作為內參照.表1原發性食管鱗癌TGFβ mRNA表達情況
2.2食管鱗癌組織Endoglin mRNA及蛋白檢測對Endoglin mRNA的定量分析［8］顯示食管癌組織中Endoglin (69.3±3.9)較癌旁組織(89.1±7.4)顯著升高(P<0.05). 採用免疫組織化學方法對腫瘤組織中Endoglin/CD105染色，如圖2所示，Endoglin/CD105分布於間質血管，陽性血管呈紫紅色（AEC顯色），而腫瘤細胞僅有輕微著色，對陽性血管定量分析顯示食管癌組織中Endoglin/CD105染色的血管平均距離（密度）為（50.4±18.4） μm.
2.3TGFβ和Endoglin的相關性分析TGFβ3 mRNA與Endoglin/CD105 mRNA的相關分析顯示有相關關係(r=0.55, P<0.05).
圖3TGFβ3 mRNA和Endoglin/CD105 mRNA在食管癌中的相關性
【關鍵詞】食管腫瘤；癌,鱗狀細胞；轉化生長因子β;,,endoglin；新生血管化,病理性
【Abstract】 AIM: To investigate the expressions of TGFβ and Endoglin/CD105 in esophageal carcinoma from patients in high incidence area in north China. METHODS: The expressions of TGFβ and Endoglin/CD105 mRNA and protEin were detected in 30 esophageal carcinoma samples using RNase protection assay and immunohistochemical staining. RESULTS: TGFβ1, TGFβ3 and Endoglin/CD105 mRNA, other than TGFβ2, were significantly increased in esophageal carcinoma than those of adjacent noncancerous tissue(P<0.05). There was a significant correlation between TGFβ3 and Endoglin/CD105 at mRNA level. CONCLUSION: The overexpressions of TGFβ1, TGFβ3 and Endoglin/CD105 may be involved in the regulation of angiogenesis in esophageal carcinoma. Endoglin/CD105 is an important angiogenesis marker as well as regulatory component on cell membrane in regulating the biological function of TGFβ. Endoglin/CD105 could be a potential target to antiangiogenesis therapy.
【Keywords】 esophageal neoplasms; carcinoma, squamous cell; transforming growth factor beta; endoglin; neovascularization, pathologic
【摘要】目的： 研究 食管鱗癌中TGFβ和Endoglin/CD105的表達及在血管生成中的作用. 方法 ： 採用RNA酶保護性 分析 和免疫組織化學方法對30例食管癌高發區食管癌患者的癌組織和癌旁組織TGFβ和Endoglin/CD105 mRNA和蛋白表達水平進行檢測. 結果： 食管癌組織中TGFβ1和TGFβ3 mRNA較癌旁組織顯著增高(P＜0.05)，TGFβ2無變化. 食管癌組織中Endoglin/CD105 mRNA較癌旁組織也顯著升高(P＜0.05). TGFβ3 mRNA與Endoglin/CD105 mRNA的相關分析顯示有相關關係. 結論： TGFβ和Endoglin/CD105參與了食管鱗癌血管生成過程的調節， Endoglin/CD105不僅是細胞膜上TGFβ受體中調節TGFβ生物學功能的一個重要分子，而且是新生血管的重要標誌. 因此調節Endoglin/CD105的功能可能成為抗血管 治療 中的一個潛在的、具有較寬生物防治譜的靶點.
【關鍵詞】食管腫瘤；癌，鱗狀細胞；轉化生長因子β; endoglin；新生血管化，病理性
TGFβ是一類多功能細胞因子，參與多種細胞功能的調節，包括細胞增殖、分化、遷移、細胞外基質的合成等［1］. TGFβ是Mr 25 000的二聚體，哺乳動物細胞中包括三種亞型： TGFβ1， TGFβ2， TGFβ3. TGFβ1在細胞生長過程中的作用較為複雜，研究顯示在不同細胞類型和/或不同階段可促進或抑制細胞生長［2］, 在多種（尤其是上皮源性）非惡性細胞中，它通過誘導細胞凋亡和/或通過上調細胞周期依賴抑制因子（p15，p21和p27）的水平將細胞阻滯在G1期從而抑制細胞的生長［2-4］. 由於惡性腫瘤細胞常存在TGFβ受體的丟失、突變和/或缺陷而對TGFβ1生長抑制作用產生抗性［2］，此外，TGFβ1可通過刺激腫瘤血管生成，細胞外基質重塑及抑制機體對腫瘤細胞的免疫反應等多種途徑促進腫瘤的生長［2,5］. 本研究對食管癌高發區食管癌患者癌組織中TGFβ和其受體調節分子Endoglin mRNA 進行檢測並探討其在血管生成中的作用.
1對象和方法
1.1對象30例食管癌標本來自食管癌高發區河南省林州市人民 醫院 199903~05間手術患者. 術中切除的食管癌標本迅速放入液氮中儲存備用. 其中男17例，女13例，年齡43~71（平均56±9）歲. 病 理學 檢查均為食管鱗狀上皮細胞癌，其中高中分化20例，低分化10例.
1.2方法
1.2.1RNA提取和多探針RNA酶保護性分析根據以往描述的方法［6］，對食管癌標本進行多部位取材，在低溫下研碎後採用Trireagent（美國MRC公司產品）提取總RNA，分光光度計（PharmaciaBiotech）檢測RNA濃度，以30 μg分裝備用. 採用多探針RNA酶保護性分析試劑盒（美國Pharmingen產品），以hck3為多探針模板（包括TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3）根據產品說明進行操作. 採用Cyclone Phosphorimager（美國HP公司產品）對mRNA表達進行定量分析. 看家基因L32作為內參照以確定RNA的上樣量，每例標本儘量重複多次，以減少誤差，部分標本因為RNA量不足，只做1次，如圖1中病例8的癌旁組織和病例9的癌組織.
1.2.2腫瘤組織中血管的組織化學染色及定量分析食管癌CD105 免疫組織化學染色及定量分析採用Fenton 等［7］的方法. ① 冰凍組織切片:新鮮標本用OCT 包埋後,4~5 μm 連續切片,儘量避開出血壞死區. 30 例新鮮組織冰凍切片後,丙酮固定10 min,空氣中乾燥10min後備用. ② 血管的組織化學染色(CD105) 方法: PBS洗10 min×1 , 5 min×1; 50 mL/L正常血清封閉30 min，PBS 洗5 min×3; 30 mL/L雙氧水5 min, PBS 洗5 min×3; CD105 (1∶100) 孵育過夜; PBS 洗5 min×3; HRP 標記的羊抗兔抗體(1∶25) 孵育1 h, PBS 洗 5 min×3; AEC顯色40 min，置於PBS 中. ③ 腫瘤血管的定量分析:在顯微鏡下採用SONY自動數碼成像系統(3CCD型) 對每一例腫瘤組織隨機選取起始點連續採集16個200×高倍視野形成一張完整腫瘤血管圖片(總面積為1514 mm2) 用於定量分析. 採用商用Imageproplus 軟體對血管進行定量分析,其原理為 計算 機隨機選取多個點以測量隨機點與血管的平均距離(以μm為單位) ,因此血管平均距離越小,血管密度越高.
統計學處理： 數據以x±s表示，使用SPSS10.0軟體進行統計分析，食管癌組織及癌旁組織mRNA分析採用配對資料t檢驗，相關分析採用直線相關分析計算相關係數，檢驗採用Pearson檢驗. P<0.05為有統計學意義.
2結果
2.1TGFβ mRNA表達水平檢測TGFβ mRNA表達水平見圖1，其量化結果見表1. 其中TGFβ1，TGFβ3在食管癌組織中的mRNA較癌旁組織明顯增高（P＜0.05）, TGFβ2與癌旁組織中相比無變化.
圖1RNA酶保護試驗檢測食管鱗癌和癌旁組織轉化生長因子mRNA表達情況
圖1中顯示病例69的TGFβ1, β2, β3的mRNA表達，N表示癌旁組織，T表示腫瘤組織，定量分析以L32作為內參照.表1原發性食管鱗癌TGFβ mRNA表達情況
2.2食管鱗癌組織Endoglin mRNA及蛋白檢測對Endoglin mRNA的定量分析［8］顯示食管癌組織中Endoglin (69.3±3.9)較癌旁組織(89.1±7.4)顯著升高(P<0.05). 採用免疫組織化學方法對腫瘤組織中Endoglin/CD105染色，如圖2所示，Endoglin/CD105分布於間質血管，陽性血管呈紫紅色（AEC顯色），而腫瘤細胞僅有輕微著色，對陽性血管定量分析顯示食管癌組織中Endoglin/CD105染色的血管平均距離（密度）為（50.4±18.4） μm.
2.3TGFβ和Endoglin的相關性分析TGFβ3 mRNA與Endoglin/CD105 mRNA的相關分析顯示有相關關係(r=0.55, P<0.05).
圖3TGFβ3 mRNA和Endoglin/CD105 mRNA在食管癌中的相關性