摘 要：
目的：建立中藥三七的 LC-MS化學模式識別方法，用於三七不同藥用部位（絨根、剪口、根條和主根）的區分，為其質量評價提供可靠數據。方法：應用 LC-MS技術建立中藥三七不同部位的指紋圖譜，獲取三七不同部位間的峰面積信息，將指紋圖譜與化學模式識別的方法相結合，利用無監督的聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）和有監督方法偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）對其進行數據處理，建立質量分類模型，尋找三七不同部位間的質量差異，以期建立可以區分中藥三七不同部位的質量分類模型。結果：採用 PLS-DA 法經過特徵提取，篩選出4個特徵性指標，四類樣品能夠實現準確的區分，經過與標準品比對，分別鑑定為人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和20(S）-人參皂苷-Rg2；通過內部驗證 ，其 R2和 Q2均符合要求，外部驗證的準確率為100%，確證了分類模型的可靠性和準確性。結論：得到的4個特徵性成分可作為典型質量標記物用於區分三七不同藥用部位，從而對三七質量評價提供數據支持。
關鍵詞:三七; 不同藥用部位; LC-MS;化學模式識別;質量評價;
Quality Evaluation of Panax Notoginseng(Burk.)F .H.Chen Based on LC-MS
Huang Yuqing Mei Jie Jiang Zhengjin Huang Yang
School of Pharmacy,Guangdong Medical University School of Pharmacy,Jinan University
Abstract：
Objective:The study aims to establish a method of chemical pattern recognition method coupled with LC-MS for the quality evaluation of Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen (P.notoginseng)including different medicinal parts(downy roots,cuts,root strips and tap roots)in order to provide a reliable data support for its quality.Methods:LC-MS fingerprints of different parts of P.notoginseng were obtained concerning their peak area.The method of LC-MS fingerprints and chemical pattern recognition including unsupervised hierarchical cluster analysis(HCA),principal component analysis(PCA)and supervised partial least squares discriminant analysis(PLS-DA)were combined to establish a quality classification model thus find quality marks for distinguishing the difference of different parts of P.notoginseng.Results:PLS-DA method was proved the effective model for their quality evaluation.Hopefully,four characteristic peaks were selected and all the selected samples could be accurately distinguished.In addition,those peaks were identified with reference materials as Ginsenoside Rb1,Ginsenoside Rb2,Ginsenoside Rb3and 20(S)-Ginsenoside-Rg2.Moreover,the established PLS-DA model was validated by internal verification(R2 and Q2)and external verification.It was found the results were all satisfactory.Conclusion:The selected four characteristic peaks could be used as potential quality markers to distinguish different parts of P.notoginsengand to provide data support for the quality evaluation of P.notoginsengas well.
Keyword：
P.Notoginseng; Different Medicinal Parts; LC-MS; Chemical Pattern Recognition; Quality Evaluation;
三七 [Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen]是五加科植物三七的乾燥根和根莖[1]，是我國重要的民族藥，其中主要含有三七皂苷[2,3]、黃酮類[4]、揮髮油[5]等多種化學成分；具有活血止血[6]、抗腫瘤[7]、降 血 糖[8]、抗 衰 老[9]等 多 種 藥 理 作 用。但市面上的三七質量參差不齊，且不同質量三七藥材之間的價格相差甚遠，故建立三七質量評價方法很有必要。《中華人民共和國藥典》[1]中收載的三七藥用部位是主根、支根和根莖，說明不同藥用部位均可入藥，但是不同部位的成分是否存在差異，截至目前研究尚少。現有標準中所涉及的方法如液相色譜、薄層色譜法均無法實現三七不同部位的準確區分[1]。本研究基於 LC-MS技術結合化學模式識別方法，以期建立三七質量評價模型，試圖區分三七不同藥用部位，完善其質量標準。
1 儀器與材料
1.1 儀器
Agilent 1260超高效液相色譜儀、Agilent OpenLab ChemStation色譜工作站（C.01.05版本）、Agilent 6130單四極杆質譜檢測器（美國 Agilent Technology公司）；spss 21.0 軟 件 （美 國IBM 公 司）；SIMCA-P 14.1 軟 件（瑞 典 Umetrics公 司）；Origin2018軟體（美國 Microcal公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；藥典篩（浙江上虞市張興紗篩廠）；KQ2200DE型數控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司；DHG 系列恆溫乾燥箱（廣州市泉宏科學儀器有限公司）；溶劑過濾器、0.22μm微孔過濾膜（有機系）、0.45μm微孔過濾膜（水系）均來自天津市津騰實驗設備有限公司。
1.2 試劑與藥材
三七皂苷 R1（批號CHB190124，純度≥98%），人參皂苷 Rb2（批號 CHB190102，純度≥98%），人參皂苷 Rb3（批號 CHB190103，純度≥98%），人參皂苷 Rd（批 號 CHB190127，純 度 ≥98%），人 參 皂苷 Re（批號 CHB190107，純度 ≥98%),20-人參皂苷 Rf（批號 CHB190108，純度≥98%),20(S）-人參皂苷-Rg2（批號 CHB190117，純度 ≥98%），以上標準品均購於成都克洛瑪生物科技有限公司，人參皂苷 Rb1（批號 P19S10U98130，純度≥98%），人參皂苷 Rc（批號 Z10S11B123849，純度≥98%），人參皂苷 Rg1（批號 G30N10Y104330，純度≥98%），均購於上海源葉生物科技有限公司。
甲酸（FA）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）購自德國默克生物科技 有 限 公 司，均 為 色 譜 純。樣 品 進 樣 前 均 用0.22μm 有機濾膜（Bonna-Agela Technologies，天津）過濾。34批樣品產地均為雲南文山，均購於雲南文 山 市 文 山 三 七 國 際 交 易 市 場，其 中 S1-S7 及S25-S29為一批次，S8-S15及 S30-S34 為 二 批 次，S16-S24為三批次，包括4批絨根、5批剪口、5批根條和20批主根。所有樣品均經深圳市藥品檢驗研究院中藥室鑑定為該類藥材。
2 方法
2.1 高效液相色譜與質譜條件
色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6mm×150mm,5μm）；流動相：ACN（含0.02%FA)(A)-H2O（含 0.02%FA)(B），梯 度 洗 脫：0～20min,20%A;20～29min,20～29%A;29～60min,29～40% A。 流 速：1mL/min；進 樣 量：5μL；柱 溫：25℃。
三七 皂 苷 存 在 形 式：化 合 物 加 鈉 形 式 （[M+Na]+）；幕簾氣：氮氣；霧化氣：幕 簾 氣；霧 化 氣 壓力：35psi；毛細管電壓：4.0kV；操作模式：選擇離子模式（SIM）；檢測模式：ESI正離子模式；乾燥氣流速：12L/min；乾燥氣溫度：350℃。三七提取物中分析物的 LC-MS裂解信息見表1。
2.2 對照品溶液的製備
分別取三七標準品各適量，精密稱定，用甲醇溶解，配 成 標 准 品 母 液，作 為 對 照 品 溶 液，儲 存 於-20℃冰箱，備用。經純甲醇稀釋，得到如下濃度的三七混標對照品溶液：0.04mg/mL 的20(S）-人參皂苷-Rg2 和人參皂苷 Rg1;0.08mg/mL 的人參皂苷 Re及20-人參皂-Rf;0.09mg/mL的三七皂苷R1;0.12mg/mL 的人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂 苷 Rb3、人參皂苷 Rc及人參皂苷 Rd。用0.22μm 微孔濾膜濾過後，取續濾液即得。
2.3 供試品溶液的製備
取過4號篩的三七樣品粉末0.3g，精密稱定，置於具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液25mL稱定重量，超聲處理2次，每次 30min，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，經0.22μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為樣品溶液。
2.4 方法學考察
2.4.1 專屬性
取三七樣本S3，按「2.3」條件處理供試品溶液，按「2.1」色譜條件進樣分析，與空白溶劑同法製備所得圖譜進行對照，結果見圖1。峰1-峰10經單標進樣對比及質譜分子量確認，指認其分別為：三 七 皂 苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、20-人參皂苷-Rf、20(S）-人參皂苷-Rg2、人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rc、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和人參皂苷 Rd。其中 Rg1和 R1的分離度大於1.5,Rg1的理論塔板數大於6 000，表明該方法符合《中華人民共和國藥典》[1]中指紋圖譜的基本要求。
2.4.2 重複性
取三七樣本S3，平行製備5份供試品溶液（S3-1-S3-5），在「2.1」色譜條件下進樣分析，記錄保留時間和峰面積。結果表明，各峰的保留時間相對標 准 偏 差（RSD）為 0.08% ～1.00%，峰面積的 RSD 為3.37%～7.80%，表明方法重現性良好，符合指紋圖譜相關要求。
2.4.3 精密度
取「2.4.2」中 S3-1供試品溶液，在「2.1」色譜條件下連續進樣5次，記錄保留時間和峰 面 積。結 果 表 明，各 峰 保 留 時 間 的 RSD 為0.10% ～0.52%，峰 面 積 的 RSD 為 4.01% ～7.26%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜相關要求。
3 結果與分析
3.1 指紋圖譜的構建
將34批樣品的指紋圖譜數據導入 Origin 2018軟體繪製出樣品峰的疊加圖譜，如圖2 所示。發現有6個相似度較高的共有峰，分別標為峰1-峰6。經指認，峰1-峰6所指示的化學成分分別為三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、20(S）-人參皂苷-Rg2、人參皂苷 Rb1和人參皂苷 Rd。由於這6個共有峰均存在不同部位的三七樣品中，難以加以區分，故將引入化學模式識別技術進行研究。
3.2 三七不同部位的化學模式識別研究
3.2.1 數據分析
通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A 版）軟體對 LC-MS指紋圖譜數據進行處理，得到其相似度結果見 表 2，由 於 不同藥用部位的色譜峰峰面積數據之間的個體差異較大，嚴重影響統計分析，故採用 SPSS 21.0軟體中 Z-score法，將34批三七不同部位樣品峰面積信息，進行標準數據 化 處 理。Z-score標 准 化 方 法 是目前最常用的多變量綜合分析方法之一，計算公式為標準化數據 =（原始數據-均值）/ 標準差。採用 SIMCA-14.1軟體 來 進 行 聚 類 分 析 （HCA），主成分分析（PCA）和 偏 最 小 二 乘 - 判 別 分 析 （PLS-DA）分析，用於分類模型的建立；當應用 PLS-DA法用於分 析 研 究 時，通 常 需 要 將 樣 品 劃 分 為 訓 練集、測試集，前者用於模型的建立，後者用於模型的驗證。
3.2.2 HCA
數 據 標 准 化 處 理 後，將 其 導 入Simca-P 14.1軟體，進行聚類分析。聚類分析結果如圖3-A 所示，34批樣品的化學信息按照相似性劃分為剪口（綠色）、絨根（藍色）和主根（紅色）三個大類，結果發現，化學信息與其他部位差別較大的剪口可實現準確區分，但化學信息相似性較高的其他類別則會出現分類錯誤，如錯誤地將 S3（主根）樣品劃分在絨根組別中，且分類類別不能識別根條組別，與按不同分類部位分出來的四組類別有所出入。結果表明，無監督的 HCA 方法並不能準確地將相似度較高的化學信息的區別並進行區分。
3.2.3 PCA
PCA 分析是應用最為廣泛的無監督模式識 別 方 法，為 直 觀 預 覽 樣 品 的 整 體 分 布 情況，本研究對34批樣品進行 PCA 分析，如圖3-B，得到 R2值與 Q2值，R2是指變量解釋模型分類的能力，數值越大，代表該模型的擬合能力越強；Q2是指變量預測分類模型的能力，其值越大，代表模型的預測能力越好。一般以 R2、Q2>0.5為指標，認為模型擬合和預測能力良好，其值越接 近 1，代 表 模型越好。結果表明，前3個主成分的累計貢獻率為93.9%，其中第一、第二和第三主成分的貢獻率分別為46.0%、29.7%和18.3%，可以表征所提取的大部分化學成分信息。且模型的 Q2=0.723，代表該模型具備 72.3% 的 預 測 准 確 率，即 該 模 型 預 測能力較強。由圖3-B可見，樣品初步按不同部位分為四類且因散點圖分布較近，質量很接近。綠色、藍色、黃色和紅色的聚類中心分別為三七剪口、根條、絨根和主根。其中剪口和絨根可以分別被區分開來，但是主根與根條兩個部位之間則無法區分。且由圖中紅色點所代表的主根 S3所在位置所示，它在分類時被分入藍色的根條類別，顯示無監督的PCA 法在分類時會造成誤判，需要通過有監督的PLS-DA 法進行進一步分析。
3.2.4 PLS-DA
本研究隨機將其中的20批樣品（S1-S15、S25-S29）劃分為訓練集，另 外 10 批 樣品作 為 驗 證 集。 首 先 對 訓 練 集 進 行 分 析，建 立PLS-DA 模型，結果如圖4-A 所示。前三個主成分的累計貢獻率為94.2%(R2 X=0.942），第一、第二和第 三 主 成 分 的 貢 獻 率 分 別 為 48.7%、29.4%、16.1%，表明可以表征所提取的大部分化學成分信息。樣品較好地形成了四個聚類中心，四類成分基本上實現了區分。訓練集 PLS-DA 模型中，模型擬合能 力 參 數 為94.2% (R2 X），模 型 區 分 參 數 為72.7%(R2Y），模型預測度為54.7%(Q2），表明模型具有良好的穩定性和預測準確性。為驗證模型是否過度擬合，對其進行了200次置換檢驗，結果如圖 4-B 所 示，其 中 R2=0.056 8<0.4,Q2=-0.465<0.05，表明模型沒有過度擬合[10]。外部檢驗。此外，我 們 還 使 用 14 批 驗 證 集 樣 品 （S16-S24、S30-34）對所建模型進行外部檢驗。結果如圖4-C所示。模型的R2 X=0.974、R2 Y=0.767和 Q2=0.478，驗證結果與訓練集較吻合，模型判別正確率為100%，進一步證實了模型的準確可靠。
特徵提取。為進一步篩選出對樣品分類貢獻較大的成分，即質量標記物，選用 PLS-DA 中最常用的 Variable Importance for the Project(V地址）值來評價變量的貢獻大小。其中V地址 值越大，代表該變量 對 分 類 的 貢 獻 度 越 大。一 般 以 V地址 值 >1.0作為指標，對變量進行篩選，並對其進行組間t檢驗，得到具有顯著差異（P<0.01）的 特 征 峰，即為特徵性成分，如圖5-A 所示。V地址 值>1.0的峰分別為峰 5、峰 6、峰 7和峰 4，經與標準品對照，指認其所代表的化合物分別為人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和20(S）-人參皂苷-Rg2。
模型再建立及驗證。為了驗證所篩選的特徵性成分是否合理，採用特徵峰對訓練集樣品再次建模，結果 如 圖 5-B 所 示。四 類 樣 品 得 到 有 效 地 區分，模型累計貢獻率（R2 X）為97.5%，可以表征絕大部分 的 化 學 信 息。且 模 型 區 分 參 數 為 73.8%(R2Y），模型預測準確度為56.8%(Q2）。且經特徵提取後再建立的 PLS-DA 模型的 S3樣本，更接近紅色的主根區域了，說明該模型具有更優的擬合能力和分類判別能力。通過對模型進行內部檢驗（圖5-C），以及外部驗證（圖5-D），說明模型具有良好的擬合能力和預測準確度。
其中內部檢驗的200次置換檢驗結果如圖5-C所示，R2=-0.003 91<0.4,Q2=-0.338<0.05，表明模型沒有過度擬合。外部驗證結果如圖5-D，且模型的累計貢獻率（R2 X）為100.0%，可以表征所有化學信息，模型區分參數為73.6%(R2 Y），模型預測準確度為 52.2%(Q2），四類樣品能夠實現有效區分，且 模 型 判 別 准 確 率 為 100%，表 明 該 模型擬合能力較強。
4 討論
4.1 色譜條件優化
本實 驗 分 別 考 察 了 不 同 柱 溫 （20℃、25℃、30℃、35℃ 和 40℃）、不 同 的 流 動 相 體 系 （0.1%FA/ACN、H2O/ACN 和 H2O/MeOH）和不同濃度的 FA 添加 劑 （0.1%、0.05% 和 0.02% 的 FA-H2O/ACN）對峰形、基線、峰響應、分離度等的影響，最終選擇25℃柱溫，使用 H2O/ACN 流動相，並添加0.02%FA 添加劑作為色譜條件。
4.2 與2020版《中華人民共和國藥典》的三七指紋圖譜比較
對比2020版《中華人民共和國藥典》中現有的指標性成分：人參皂苷 Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷 R1，本實驗所篩選出的特徵性成分與藥典規定的指標有重合（人參皂苷 Rb1），但也在藥典的基礎上更多了三個指標性成分：人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和人參皂苷 Rg2，說明化學模式識別技術的引入可以實現三七不同部位的質量區分，這也說明這些不同藥用部位的質量是存在一定的區別，但其藥效上的差異還有待進一步研究。
4.3 PLS-DA法和 PCA 法的R2 X、R2Y 和Q2的參數對比
將幾種模型進行比較，發現結果如表4所示，PLS-DA 模型能夠實現四類不同藥用部位的準確區分；和特徵提取後的 PLS-DA 相比，R2 X、R2 Y 和Q2均明顯提高，表明模型區分能力也有所提升，預測能力符合規定，說明該4個特徵成分能夠為三七不同藥用部位的區分提供更加有效的數據支持。
5 結論
本研究表明通過將化學模式識別方法與 LC-MS指紋圖譜相結合，建立了區分三七不同部位的PLS-DA 模型，所得到的四個特徵性成分人參皂苷Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和20(S）-人參皂苷-Rg2，該特徵性成分能夠較好地實現中藥三七四種不同藥用部位的區分。這可對三七質量控制標準提供可靠數據與有效補充。
參考文獻
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目的：建立中藥三七的 LC-MS化學模式識別方法，用於三七不同藥用部位（絨根、剪口、根條和主根）的區分，為其質量評價提供可靠數據。方法：應用 LC-MS技術建立中藥三七不同部位的指紋圖譜，獲取三七不同部位間的峰面積信息，將指紋圖譜與化學模式識別的方法相結合，利用無監督的聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）和有監督方法偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）對其進行數據處理，建立質量分類模型，尋找三七不同部位間的質量差異，以期建立可以區分中藥三七不同部位的質量分類模型。結果：採用 PLS-DA 法經過特徵提取，篩選出4個特徵性指標，四類樣品能夠實現準確的區分，經過與標準品比對，分別鑑定為人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和20(S）-人參皂苷-Rg2；通過內部驗證 ，其 R2和 Q2均符合要求，外部驗證的準確率為100%，確證了分類模型的可靠性和準確性。結論：得到的4個特徵性成分可作為典型質量標記物用於區分三七不同藥用部位，從而對三七質量評價提供數據支持。
關鍵詞:三七; 不同藥用部位; LC-MS;化學模式識別;質量評價;
Quality Evaluation of Panax Notoginseng(Burk.)F .H.Chen Based on LC-MS
Huang Yuqing Mei Jie Jiang Zhengjin Huang Yang
School of Pharmacy,Guangdong Medical University School of Pharmacy,Jinan University
Abstract：
Objective:The study aims to establish a method of chemical pattern recognition method coupled with LC-MS for the quality evaluation of Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen (P.notoginseng)including different medicinal parts(downy roots,cuts,root strips and tap roots)in order to provide a reliable data support for its quality.Methods:LC-MS fingerprints of different parts of P.notoginseng were obtained concerning their peak area.The method of LC-MS fingerprints and chemical pattern recognition including unsupervised hierarchical cluster analysis(HCA),principal component analysis(PCA)and supervised partial least squares discriminant analysis(PLS-DA)were combined to establish a quality classification model thus find quality marks for distinguishing the difference of different parts of P.notoginseng.Results:PLS-DA method was proved the effective model for their quality evaluation.Hopefully,four characteristic peaks were selected and all the selected samples could be accurately distinguished.In addition,those peaks were identified with reference materials as Ginsenoside Rb1,Ginsenoside Rb2,Ginsenoside Rb3and 20(S)-Ginsenoside-Rg2.Moreover,the established PLS-DA model was validated by internal verification(R2 and Q2)and external verification.It was found the results were all satisfactory.Conclusion:The selected four characteristic peaks could be used as potential quality markers to distinguish different parts of P.notoginsengand to provide data support for the quality evaluation of P.notoginsengas well.
Keyword：
P.Notoginseng; Different Medicinal Parts; LC-MS; Chemical Pattern Recognition; Quality Evaluation;
三七 [Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen]是五加科植物三七的乾燥根和根莖[1]，是我國重要的民族藥，其中主要含有三七皂苷[2,3]、黃酮類[4]、揮髮油[5]等多種化學成分；具有活血止血[6]、抗腫瘤[7]、降 血 糖[8]、抗 衰 老[9]等 多 種 藥 理 作 用。但市面上的三七質量參差不齊，且不同質量三七藥材之間的價格相差甚遠，故建立三七質量評價方法很有必要。《中華人民共和國藥典》[1]中收載的三七藥用部位是主根、支根和根莖，說明不同藥用部位均可入藥，但是不同部位的成分是否存在差異，截至目前研究尚少。現有標準中所涉及的方法如液相色譜、薄層色譜法均無法實現三七不同部位的準確區分[1]。本研究基於 LC-MS技術結合化學模式識別方法，以期建立三七質量評價模型，試圖區分三七不同藥用部位，完善其質量標準。
1 儀器與材料
1.1 儀器
Agilent 1260超高效液相色譜儀、Agilent OpenLab ChemStation色譜工作站（C.01.05版本）、Agilent 6130單四極杆質譜檢測器（美國 Agilent Technology公司）；spss 21.0 軟 件 （美 國IBM 公 司）；SIMCA-P 14.1 軟 件（瑞 典 Umetrics公 司）；Origin2018軟體（美國 Microcal公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；藥典篩（浙江上虞市張興紗篩廠）；KQ2200DE型數控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司；DHG 系列恆溫乾燥箱（廣州市泉宏科學儀器有限公司）；溶劑過濾器、0.22μm微孔過濾膜（有機系）、0.45μm微孔過濾膜（水系）均來自天津市津騰實驗設備有限公司。
1.2 試劑與藥材
三七皂苷 R1（批號CHB190124，純度≥98%），人參皂苷 Rb2（批號 CHB190102，純度≥98%），人參皂苷 Rb3（批號 CHB190103，純度≥98%），人參皂苷 Rd（批 號 CHB190127，純 度 ≥98%），人 參 皂苷 Re（批號 CHB190107，純度 ≥98%),20-人參皂苷 Rf（批號 CHB190108，純度≥98%),20(S）-人參皂苷-Rg2（批號 CHB190117，純度 ≥98%），以上標準品均購於成都克洛瑪生物科技有限公司，人參皂苷 Rb1（批號 P19S10U98130，純度≥98%），人參皂苷 Rc（批號 Z10S11B123849，純度≥98%），人參皂苷 Rg1（批號 G30N10Y104330，純度≥98%），均購於上海源葉生物科技有限公司。
甲酸（FA）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）購自德國默克生物科技 有 限 公 司，均 為 色 譜 純。樣 品 進 樣 前 均 用0.22μm 有機濾膜（Bonna-Agela Technologies，天津）過濾。34批樣品產地均為雲南文山，均購於雲南文 山 市 文 山 三 七 國 際 交 易 市 場，其 中 S1-S7 及S25-S29為一批次，S8-S15及 S30-S34 為 二 批 次，S16-S24為三批次，包括4批絨根、5批剪口、5批根條和20批主根。所有樣品均經深圳市藥品檢驗研究院中藥室鑑定為該類藥材。
2 方法
2.1 高效液相色譜與質譜條件
色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6mm×150mm,5μm）；流動相：ACN（含0.02%FA)(A)-H2O（含 0.02%FA)(B），梯 度 洗 脫：0～20min,20%A;20～29min,20～29%A;29～60min,29～40% A。 流 速：1mL/min；進 樣 量：5μL；柱 溫：25℃。
三七 皂 苷 存 在 形 式：化 合 物 加 鈉 形 式 （[M+Na]+）；幕簾氣：氮氣；霧化氣：幕 簾 氣；霧 化 氣 壓力：35psi；毛細管電壓：4.0kV；操作模式：選擇離子模式（SIM）；檢測模式：ESI正離子模式；乾燥氣流速：12L/min；乾燥氣溫度：350℃。三七提取物中分析物的 LC-MS裂解信息見表1。
2.2 對照品溶液的製備
分別取三七標準品各適量，精密稱定，用甲醇溶解，配 成 標 准 品 母 液，作 為 對 照 品 溶 液，儲 存 於-20℃冰箱，備用。經純甲醇稀釋，得到如下濃度的三七混標對照品溶液：0.04mg/mL 的20(S）-人參皂苷-Rg2 和人參皂苷 Rg1;0.08mg/mL 的人參皂苷 Re及20-人參皂-Rf;0.09mg/mL的三七皂苷R1;0.12mg/mL 的人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂 苷 Rb3、人參皂苷 Rc及人參皂苷 Rd。用0.22μm 微孔濾膜濾過後，取續濾液即得。
2.3 供試品溶液的製備
取過4號篩的三七樣品粉末0.3g，精密稱定，置於具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液25mL稱定重量，超聲處理2次，每次 30min，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，經0.22μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為樣品溶液。
2.4 方法學考察
2.4.1 專屬性
取三七樣本S3，按「2.3」條件處理供試品溶液，按「2.1」色譜條件進樣分析，與空白溶劑同法製備所得圖譜進行對照，結果見圖1。峰1-峰10經單標進樣對比及質譜分子量確認，指認其分別為：三 七 皂 苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、20-人參皂苷-Rf、20(S）-人參皂苷-Rg2、人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rc、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和人參皂苷 Rd。其中 Rg1和 R1的分離度大於1.5,Rg1的理論塔板數大於6 000，表明該方法符合《中華人民共和國藥典》[1]中指紋圖譜的基本要求。
2.4.2 重複性
取三七樣本S3，平行製備5份供試品溶液（S3-1-S3-5），在「2.1」色譜條件下進樣分析，記錄保留時間和峰面積。結果表明，各峰的保留時間相對標 准 偏 差（RSD）為 0.08% ～1.00%，峰面積的 RSD 為3.37%～7.80%，表明方法重現性良好，符合指紋圖譜相關要求。
2.4.3 精密度
取「2.4.2」中 S3-1供試品溶液，在「2.1」色譜條件下連續進樣5次，記錄保留時間和峰 面 積。結 果 表 明，各 峰 保 留 時 間 的 RSD 為0.10% ～0.52%，峰 面 積 的 RSD 為 4.01% ～7.26%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜相關要求。
3 結果與分析
3.1 指紋圖譜的構建
將34批樣品的指紋圖譜數據導入 Origin 2018軟體繪製出樣品峰的疊加圖譜，如圖2 所示。發現有6個相似度較高的共有峰，分別標為峰1-峰6。經指認，峰1-峰6所指示的化學成分分別為三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、20(S）-人參皂苷-Rg2、人參皂苷 Rb1和人參皂苷 Rd。由於這6個共有峰均存在不同部位的三七樣品中，難以加以區分，故將引入化學模式識別技術進行研究。
3.2 三七不同部位的化學模式識別研究
3.2.1 數據分析
通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A 版）軟體對 LC-MS指紋圖譜數據進行處理，得到其相似度結果見 表 2，由 於 不同藥用部位的色譜峰峰面積數據之間的個體差異較大，嚴重影響統計分析，故採用 SPSS 21.0軟體中 Z-score法，將34批三七不同部位樣品峰面積信息，進行標準數據 化 處 理。Z-score標 准 化 方 法 是目前最常用的多變量綜合分析方法之一，計算公式為標準化數據 =（原始數據-均值）/ 標準差。採用 SIMCA-14.1軟體 來 進 行 聚 類 分 析 （HCA），主成分分析（PCA）和 偏 最 小 二 乘 - 判 別 分 析 （PLS-DA）分析，用於分類模型的建立；當應用 PLS-DA法用於分 析 研 究 時，通 常 需 要 將 樣 品 劃 分 為 訓 練集、測試集，前者用於模型的建立，後者用於模型的驗證。
3.2.2 HCA
數 據 標 准 化 處 理 後，將 其 導 入Simca-P 14.1軟體，進行聚類分析。聚類分析結果如圖3-A 所示，34批樣品的化學信息按照相似性劃分為剪口（綠色）、絨根（藍色）和主根（紅色）三個大類，結果發現，化學信息與其他部位差別較大的剪口可實現準確區分，但化學信息相似性較高的其他類別則會出現分類錯誤，如錯誤地將 S3（主根）樣品劃分在絨根組別中，且分類類別不能識別根條組別，與按不同分類部位分出來的四組類別有所出入。結果表明，無監督的 HCA 方法並不能準確地將相似度較高的化學信息的區別並進行區分。
3.2.3 PCA
PCA 分析是應用最為廣泛的無監督模式識 別 方 法，為 直 觀 預 覽 樣 品 的 整 體 分 布 情況，本研究對34批樣品進行 PCA 分析，如圖3-B，得到 R2值與 Q2值，R2是指變量解釋模型分類的能力，數值越大，代表該模型的擬合能力越強；Q2是指變量預測分類模型的能力，其值越大，代表模型的預測能力越好。一般以 R2、Q2>0.5為指標，認為模型擬合和預測能力良好，其值越接 近 1，代 表 模型越好。結果表明，前3個主成分的累計貢獻率為93.9%，其中第一、第二和第三主成分的貢獻率分別為46.0%、29.7%和18.3%，可以表征所提取的大部分化學成分信息。且模型的 Q2=0.723，代表該模型具備 72.3% 的 預 測 准 確 率，即 該 模 型 預 測能力較強。由圖3-B可見，樣品初步按不同部位分為四類且因散點圖分布較近，質量很接近。綠色、藍色、黃色和紅色的聚類中心分別為三七剪口、根條、絨根和主根。其中剪口和絨根可以分別被區分開來，但是主根與根條兩個部位之間則無法區分。且由圖中紅色點所代表的主根 S3所在位置所示，它在分類時被分入藍色的根條類別，顯示無監督的PCA 法在分類時會造成誤判，需要通過有監督的PLS-DA 法進行進一步分析。
3.2.4 PLS-DA
本研究隨機將其中的20批樣品（S1-S15、S25-S29）劃分為訓練集，另 外 10 批 樣品作 為 驗 證 集。 首 先 對 訓 練 集 進 行 分 析，建 立PLS-DA 模型，結果如圖4-A 所示。前三個主成分的累計貢獻率為94.2%(R2 X=0.942），第一、第二和第 三 主 成 分 的 貢 獻 率 分 別 為 48.7%、29.4%、16.1%，表明可以表征所提取的大部分化學成分信息。樣品較好地形成了四個聚類中心，四類成分基本上實現了區分。訓練集 PLS-DA 模型中，模型擬合能 力 參 數 為94.2% (R2 X），模 型 區 分 參 數 為72.7%(R2Y），模型預測度為54.7%(Q2），表明模型具有良好的穩定性和預測準確性。為驗證模型是否過度擬合，對其進行了200次置換檢驗，結果如圖 4-B 所 示，其 中 R2=0.056 8<0.4,Q2=-0.465<0.05，表明模型沒有過度擬合[10]。外部檢驗。此外，我 們 還 使 用 14 批 驗 證 集 樣 品 （S16-S24、S30-34）對所建模型進行外部檢驗。結果如圖4-C所示。模型的R2 X=0.974、R2 Y=0.767和 Q2=0.478，驗證結果與訓練集較吻合，模型判別正確率為100%，進一步證實了模型的準確可靠。
特徵提取。為進一步篩選出對樣品分類貢獻較大的成分，即質量標記物，選用 PLS-DA 中最常用的 Variable Importance for the Project(V地址）值來評價變量的貢獻大小。其中V地址 值越大，代表該變量 對 分 類 的 貢 獻 度 越 大。一 般 以 V地址 值 >1.0作為指標，對變量進行篩選，並對其進行組間t檢驗，得到具有顯著差異（P<0.01）的 特 征 峰，即為特徵性成分，如圖5-A 所示。V地址 值>1.0的峰分別為峰 5、峰 6、峰 7和峰 4，經與標準品對照，指認其所代表的化合物分別為人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和20(S）-人參皂苷-Rg2。
模型再建立及驗證。為了驗證所篩選的特徵性成分是否合理，採用特徵峰對訓練集樣品再次建模，結果 如 圖 5-B 所 示。四 類 樣 品 得 到 有 效 地 區分，模型累計貢獻率（R2 X）為97.5%，可以表征絕大部分 的 化 學 信 息。且 模 型 區 分 參 數 為 73.8%(R2Y），模型預測準確度為56.8%(Q2）。且經特徵提取後再建立的 PLS-DA 模型的 S3樣本，更接近紅色的主根區域了，說明該模型具有更優的擬合能力和分類判別能力。通過對模型進行內部檢驗（圖5-C），以及外部驗證（圖5-D），說明模型具有良好的擬合能力和預測準確度。
其中內部檢驗的200次置換檢驗結果如圖5-C所示，R2=-0.003 91<0.4,Q2=-0.338<0.05，表明模型沒有過度擬合。外部驗證結果如圖5-D，且模型的累計貢獻率（R2 X）為100.0%，可以表征所有化學信息，模型區分參數為73.6%(R2 Y），模型預測準確度為 52.2%(Q2），四類樣品能夠實現有效區分，且 模 型 判 別 准 確 率 為 100%，表 明 該 模型擬合能力較強。
4 討論
4.1 色譜條件優化
本實 驗 分 別 考 察 了 不 同 柱 溫 （20℃、25℃、30℃、35℃ 和 40℃）、不 同 的 流 動 相 體 系 （0.1%FA/ACN、H2O/ACN 和 H2O/MeOH）和不同濃度的 FA 添加 劑 （0.1%、0.05% 和 0.02% 的 FA-H2O/ACN）對峰形、基線、峰響應、分離度等的影響，最終選擇25℃柱溫，使用 H2O/ACN 流動相，並添加0.02%FA 添加劑作為色譜條件。
4.2 與2020版《中華人民共和國藥典》的三七指紋圖譜比較
對比2020版《中華人民共和國藥典》中現有的指標性成分：人參皂苷 Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷 R1，本實驗所篩選出的特徵性成分與藥典規定的指標有重合（人參皂苷 Rb1），但也在藥典的基礎上更多了三個指標性成分：人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和人參皂苷 Rg2，說明化學模式識別技術的引入可以實現三七不同部位的質量區分，這也說明這些不同藥用部位的質量是存在一定的區別，但其藥效上的差異還有待進一步研究。
4.3 PLS-DA法和 PCA 法的R2 X、R2Y 和Q2的參數對比
將幾種模型進行比較，發現結果如表4所示，PLS-DA 模型能夠實現四類不同藥用部位的準確區分；和特徵提取後的 PLS-DA 相比，R2 X、R2 Y 和Q2均明顯提高，表明模型區分能力也有所提升，預測能力符合規定，說明該4個特徵成分能夠為三七不同藥用部位的區分提供更加有效的數據支持。
5 結論
本研究表明通過將化學模式識別方法與 LC-MS指紋圖譜相結合，建立了區分三七不同部位的PLS-DA 模型，所得到的四個特徵性成分人參皂苷Rb1、人參皂苷 Rb2、人參皂苷 Rb3和20(S）-人參皂苷-Rg2，該特徵性成分能夠較好地實現中藥三七四種不同藥用部位的區分。這可對三七質量控制標準提供可靠數據與有效補充。
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