作者：木拉提·克扎衣別克 阿不都熱依木·玉蘇甫 哈木拉提·吾甫爾
【摘要】 目的檢測異常黑膽質成熟劑中總黃酮和總酚的含量。 方法以蘆丁為對照品，採用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定了總黃酮含量；以沒食子酸為對照品，採用Folin-Ciocalteu比色法測定了總酚含量。結果蘆丁濃度在0.011～0.130 mg/ml範圍內線性關係良好，最低檢測限為0.06 μg/ml，最低定量限為0.18 μg/ml。該方法加樣回收率為95.1%～97.5%，精密度為1.34%，水提物和醇提物中總黃酮含量分別為16.2 mg/g和19.0 mg/g。沒食子酸濃度在1.1～7.7 μg/ml範圍內線性關係良好，最低檢測限為0.01μg/ml，最低定量限為0.03 μg/ml。該方法加樣回收率為99.5%～104.8%，精密度為3.39%，水提物和醇提物中總酚含量分別為38.28 mg/g和21.54 mg/g。結論此兩種方法靈敏、準確性強，精密度高，重複性好，分別可以用作異常黑膽質成熟劑中總黃酮和總酚含量的測定。
【關鍵詞】 異常黑膽質成熟劑 總黃酮 總酚 含量測定
異常黑膽質成熟劑是維吾爾醫常用復方製劑，由破布木Cordia dichotoma Forst.，紅棗Ziziphus jujuba Mill.，甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.，牛舌草Anchusa italica Retz.，小茴香Foeniculum vulgare Mill.，地錦草Euphorbia humifusa Willd.等藥材組成,用於 治療 由異常黑膽質所導致的腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。 現代 研究已證實，異常黑膽質成熟劑可清除自由基、提高患者抗氧化功能、保護羥自由基引發的DNA氧化損傷和線粒體氧化損傷等，具有較強的抑制HepG2細胞體外生長、抑制HepG2細胞DNA、RNA和蛋白質生物合成等作用。以往的研究結果還表明，異常黑膽質成熟劑的總黃酮部位能明顯抑制癌細胞生長、誘導癌細胞凋亡及調控凋亡基因表達等［1～3］。研究報道破布木、地錦草、甘草、牛舌草等含豐富的黃酮類化合物外，還含有其他非黃酮類多酚化合物［4～7］。本文採用分光光度法對異常黑膽質成熟劑水提物總黃酮及總酚含量測定的方法進行了系統研究。現報道如下。
1 器材
1.1 藥材 組成異常黑膽質成熟劑復方製劑的每味藥材均購自新疆維吾爾醫 醫院 製劑中心，並由該中心鑑定。
1.2 儀器 Cintra 40紫外可見分光光度計(澳大利亞GBC 科學 儀器公司)；Sartorius BS110S精密 電子 天平（德國Sartorius）；旋渦振蕩器；離心機。
1.3 試劑 蘆丁標準品購自 中國 藥品生物製品鑑定所，批號為0080-9705；沒食子酸購自天津市光復精細化工研究所，批號為20060508；其它試劑均為A.R 級。
2 方法與結果
2.1 總黃酮的測定
2.1.1 樣品溶液的製備 精密稱取異常黑膽質成熟劑乾燥粉末0.5 g，置10 ml具塞試管中，加入4 ml沸水，攪拌，充分溶解後加入無水乙醇6 ml，置於漩渦振蕩器上振蕩3 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液；沉澱物再加沸水4 ml，攪拌，充分溶解後加入無水乙醇6 ml，置於漩渦振蕩器上振蕩3 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液；兩次上清液合併，置於25 ml容量瓶中，加60%乙醇至刻度，備用。
2.1.2 對照品溶液的配製 精確稱取已烘乾至恆重的蘆丁標準品（純度≥98%）18.6 mg，置於50 ml容量瓶中，用60%乙醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（每毫升含無水蘆丁0.372 mg）。
2.1.3 氫氧化鈉溶液及乙醇用量的選擇 本實驗室用比色法進行異常黑膽質成熟劑水提物中黃酮含量測定時發現若按照常規的比色法進行測定樣品溶液中會出現一些隨時間延長逐漸增多的紅色絮狀的漂浮物，造成吸光度顯著波動，影響測定結果的穩定性、準確性和重複性，發現僅含相同濃度顯色試劑和乙醇的空白溶液同樣有絮狀物(白色)存在，因此可以認為這種現象是由溶液中氫氧化鈉、水和乙醇三元體系不適當配比所造成，而不是樣品中含有的干擾性雜質引起，這種在乙醇的鹽析作用下析出的氫氧化鈉絮狀物因孔隙多具有很強的吸附能力，將溶液中的有色物質吸附在其表面上，從而產生紅色絮狀的漂流物，造成總黃酮濃度的測定結果偏高且不穩定。通過將4%氫氧化鈉溶液的用量從4 ml減到2 ml並選擇水作為補充溶劑，徹底排除了紅色絮狀物，大大改善了總黃酮測定方法的穩定性和準確度（見圖1）。實驗結果還表明，氫氧化鈉溶液新調整的用量仍為過量，完全可以確保黃酮類成分充分反應。
2.1.4 測定波長的選擇精密吸取對照品溶液1.0和0.0 ml及供試品溶液1.0，1.0和1.0 ml，分別置10 ml量瓶中，5份溶液分別標記為1，2，3，4，5號，按表1和表2定量加入水和/或顯色劑，注意控制顯色試劑加入時間：加入5%NaNO2 0.3 ml，搖勻,放置6min;分別加入10%Al(NO3)3 0.3 ml，搖勻，放置6 min；再分別加入4%NaOH溶液2 ml，最後用蒸餾水分別稀釋至刻度, 搖勻。不加顯色試劑的以等量水來代替，以使溶液含醇量始終保持不變。
然後在可見紫外分光光度計上在300～600 nm波長範圍內，以2號溶液作為空白對照，對3，4和5號溶液進行掃描，分別繪製待測溶液的3種吸收光譜圖。見圖2。
圖2表明，樣品在此波長處卻無明顯吸收峰。但已被顯色的待測溶液（樣品3）與未加入硝酸鋁溶液的樣品溶液(樣品2)在510 nm波長處的吸光度之差ΔA值最大，因此，以5號溶液為空白，在400～600 nm波長範圍內對4號溶液進行掃描，得樣品溶液的吸收光譜圖(Munziq)。與蘆丁溶液顯色之後的吸收光譜圖(Rutin，以1號溶液為空白，對2號溶液進行波長掃描)繪製在同一坐標上，得圖3。
由圖3確定，在510 nm處，對照品和樣品有共同的最大吸收峰，因此，我們以510 nm作為測定波長。對照品測定時，以 1號溶液為空白，測定2號溶液的吸光度；供試品測定時，以5號溶液為空白，測定4號溶液的吸光度。
2.1.5 標準曲線的製備分別精密吸取對照品溶液0，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，3.5 ml標準品溶液分別置於10 ml容量瓶中,接著向容量瓶中依次加入4.7，4.5，4.0，3.0，2.0，1.5 ml蒸餾水,使各容量瓶中的溶液總體積均變成5 ml，加入5%NaNO2 0.3ml，搖勻，放置6 min；分別加入10% Al(NO3)3 0.3 ml， 搖勻，放置6 min；再分別加入1 mol/L NaOH溶液2 ml，最後用蒸餾水分別稀釋至刻度, 搖勻。以第1瓶溶液作為空白參照,分別在分光光度計上測A510。結果見表3。
表1 1號和2號溶液的組成ml（略）
表2 3～5號溶液的組成ml（略）
圖1 改進前後的吸光度動力學測量曲線比較（略）
圖2 待測溶液的吸收光譜圖（略）
圖3 樣品與蘆丁溶液的吸收光譜圖比較（略）
表3 不同濃度蘆丁的吸光度及LOD，LOQ值（略）
實驗結果表明，蘆丁濃度在0.011～0.130 mg/ml範圍內線性關係良好。得回歸方程：A= 11.356C-0.008，相關係數r=0.999 9。最低檢測限為0.06 μg/ml，最低定量限為0.18 μg/ml。
【摘要】 目的檢測異常黑膽質成熟劑中總黃酮和總酚的含量。 方法以蘆丁為對照品，採用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定了總黃酮含量；以沒食子酸為對照品，採用Folin-Ciocalteu比色法測定了總酚含量。結果蘆丁濃度在0.011～0.130 mg/ml範圍內線性關係良好，最低檢測限為0.06 μg/ml，最低定量限為0.18 μg/ml。該方法加樣回收率為95.1%～97.5%，精密度為1.34%，水提物和醇提物中總黃酮含量分別為16.2 mg/g和19.0 mg/g。沒食子酸濃度在1.1～7.7 μg/ml範圍內線性關係良好，最低檢測限為0.01μg/ml，最低定量限為0.03 μg/ml。該方法加樣回收率為99.5%～104.8%，精密度為3.39%，水提物和醇提物中總酚含量分別為38.28 mg/g和21.54 mg/g。結論此兩種方法靈敏、準確性強，精密度高，重複性好，分別可以用作異常黑膽質成熟劑中總黃酮和總酚含量的測定。
【關鍵詞】 異常黑膽質成熟劑 總黃酮 總酚 含量測定
異常黑膽質成熟劑是維吾爾醫常用復方製劑，由破布木Cordia dichotoma Forst.，紅棗Ziziphus jujuba Mill.，甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.，牛舌草Anchusa italica Retz.，小茴香Foeniculum vulgare Mill.，地錦草Euphorbia humifusa Willd.等藥材組成,用於 治療 由異常黑膽質所導致的腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。 現代 研究已證實，異常黑膽質成熟劑可清除自由基、提高患者抗氧化功能、保護羥自由基引發的DNA氧化損傷和線粒體氧化損傷等，具有較強的抑制HepG2細胞體外生長、抑制HepG2細胞DNA、RNA和蛋白質生物合成等作用。以往的研究結果還表明，異常黑膽質成熟劑的總黃酮部位能明顯抑制癌細胞生長、誘導癌細胞凋亡及調控凋亡基因表達等［1～3］。研究報道破布木、地錦草、甘草、牛舌草等含豐富的黃酮類化合物外，還含有其他非黃酮類多酚化合物［4～7］。本文採用分光光度法對異常黑膽質成熟劑水提物總黃酮及總酚含量測定的方法進行了系統研究。現報道如下。
1 器材
1.1 藥材 組成異常黑膽質成熟劑復方製劑的每味藥材均購自新疆維吾爾醫 醫院 製劑中心，並由該中心鑑定。
1.2 儀器 Cintra 40紫外可見分光光度計(澳大利亞GBC 科學 儀器公司)；Sartorius BS110S精密 電子 天平（德國Sartorius）；旋渦振蕩器；離心機。
1.3 試劑 蘆丁標準品購自 中國 藥品生物製品鑑定所，批號為0080-9705；沒食子酸購自天津市光復精細化工研究所，批號為20060508；其它試劑均為A.R 級。
2 方法與結果
2.1 總黃酮的測定
2.1.1 樣品溶液的製備 精密稱取異常黑膽質成熟劑乾燥粉末0.5 g，置10 ml具塞試管中，加入4 ml沸水，攪拌，充分溶解後加入無水乙醇6 ml，置於漩渦振蕩器上振蕩3 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液；沉澱物再加沸水4 ml，攪拌，充分溶解後加入無水乙醇6 ml，置於漩渦振蕩器上振蕩3 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液；兩次上清液合併，置於25 ml容量瓶中，加60%乙醇至刻度，備用。
2.1.2 對照品溶液的配製 精確稱取已烘乾至恆重的蘆丁標準品（純度≥98%）18.6 mg，置於50 ml容量瓶中，用60%乙醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（每毫升含無水蘆丁0.372 mg）。
2.1.3 氫氧化鈉溶液及乙醇用量的選擇 本實驗室用比色法進行異常黑膽質成熟劑水提物中黃酮含量測定時發現若按照常規的比色法進行測定樣品溶液中會出現一些隨時間延長逐漸增多的紅色絮狀的漂浮物，造成吸光度顯著波動，影響測定結果的穩定性、準確性和重複性，發現僅含相同濃度顯色試劑和乙醇的空白溶液同樣有絮狀物(白色)存在，因此可以認為這種現象是由溶液中氫氧化鈉、水和乙醇三元體系不適當配比所造成，而不是樣品中含有的干擾性雜質引起，這種在乙醇的鹽析作用下析出的氫氧化鈉絮狀物因孔隙多具有很強的吸附能力，將溶液中的有色物質吸附在其表面上，從而產生紅色絮狀的漂流物，造成總黃酮濃度的測定結果偏高且不穩定。通過將4%氫氧化鈉溶液的用量從4 ml減到2 ml並選擇水作為補充溶劑，徹底排除了紅色絮狀物，大大改善了總黃酮測定方法的穩定性和準確度（見圖1）。實驗結果還表明，氫氧化鈉溶液新調整的用量仍為過量，完全可以確保黃酮類成分充分反應。
2.1.4 測定波長的選擇精密吸取對照品溶液1.0和0.0 ml及供試品溶液1.0，1.0和1.0 ml，分別置10 ml量瓶中，5份溶液分別標記為1，2，3，4，5號，按表1和表2定量加入水和/或顯色劑，注意控制顯色試劑加入時間：加入5%NaNO2 0.3 ml，搖勻,放置6min;分別加入10%Al(NO3)3 0.3 ml，搖勻，放置6 min；再分別加入4%NaOH溶液2 ml，最後用蒸餾水分別稀釋至刻度, 搖勻。不加顯色試劑的以等量水來代替，以使溶液含醇量始終保持不變。
然後在可見紫外分光光度計上在300～600 nm波長範圍內，以2號溶液作為空白對照，對3，4和5號溶液進行掃描，分別繪製待測溶液的3種吸收光譜圖。見圖2。
圖2表明，樣品在此波長處卻無明顯吸收峰。但已被顯色的待測溶液（樣品3）與未加入硝酸鋁溶液的樣品溶液(樣品2)在510 nm波長處的吸光度之差ΔA值最大，因此，以5號溶液為空白，在400～600 nm波長範圍內對4號溶液進行掃描，得樣品溶液的吸收光譜圖(Munziq)。與蘆丁溶液顯色之後的吸收光譜圖(Rutin，以1號溶液為空白，對2號溶液進行波長掃描)繪製在同一坐標上，得圖3。
由圖3確定，在510 nm處，對照品和樣品有共同的最大吸收峰，因此，我們以510 nm作為測定波長。對照品測定時，以 1號溶液為空白，測定2號溶液的吸光度；供試品測定時，以5號溶液為空白，測定4號溶液的吸光度。
2.1.5 標準曲線的製備分別精密吸取對照品溶液0，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，3.5 ml標準品溶液分別置於10 ml容量瓶中,接著向容量瓶中依次加入4.7，4.5，4.0，3.0，2.0，1.5 ml蒸餾水,使各容量瓶中的溶液總體積均變成5 ml，加入5%NaNO2 0.3ml，搖勻，放置6 min；分別加入10% Al(NO3)3 0.3 ml， 搖勻，放置6 min；再分別加入1 mol/L NaOH溶液2 ml，最後用蒸餾水分別稀釋至刻度, 搖勻。以第1瓶溶液作為空白參照,分別在分光光度計上測A510。結果見表3。
表1 1號和2號溶液的組成ml（略）
表2 3～5號溶液的組成ml（略）
圖1 改進前後的吸光度動力學測量曲線比較（略）
圖2 待測溶液的吸收光譜圖（略）
圖3 樣品與蘆丁溶液的吸收光譜圖比較（略）
表3 不同濃度蘆丁的吸光度及LOD，LOQ值（略）
實驗結果表明，蘆丁濃度在0.011～0.130 mg/ml範圍內線性關係良好。得回歸方程：A= 11.356C-0.008，相關係數r=0.999 9。最低檢測限為0.06 μg/ml，最低定量限為0.18 μg/ml。
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