Kim［1］於1994年藉助PCR技術建立了靈敏的端粒酶檢測 方法 ——端粒重複片段擴增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。我們對Kim的方法加以改進，建立了簡便、非同位素的銀染檢測法，檢測了腦瘤、腸癌、食管癌中端粒酶的活性。
一、材料與方法
1.總蛋白提取：手術後取下的活組織，液氮保存。(1)100 ml提取液中含10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L β-巰基乙醇；0.5% CHAPS，體積分數為10%的甘油。(2)組織中提取總蛋白：取約30 mg組織用無菌眼科手術剪儘量剪碎，加入200 μl提取液，冰浴30 min後，4 ℃ 1 600 g離心20 min。吸取上清約150 μl待測。
2.TRAP反應：(1)引物及稀釋：RNA模板逆轉錄引物TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′18mer，MW=5 524，濃度為0.541 g/L。PCR引物CX：5′-CCTTACCCTTACCCTTACCC
TAA3′24mer,MW=7 104,濃度為0.688 g/L。(2)PCR擴增：①將Kim［1］的方法改進為：50 μl PCR液含20 mmol/L Tris-HCl (pH8.3);1.5 mmol/L MgCl2;63 mmol/L KCl;0.005%Tween-20;1 mmol/L EGTA;200 μmmol/L dNTP;0.1 μgT4 g32 蛋白;0.1 μg/L牛血清白蛋白;0.1 μg TS引物;2 U Taqase;0.5～1.0 mg總蛋白。②25℃ 20 min，加入0.1 μg CX引物。③94℃預變性5 min，94℃30 s→50℃ s→72℃90 s 30個循壞，72℃延伸10 min。
3.電泳:12%非變性聚丙烯醯胺凝膠，取10 μl PCR產物，加2 μl 6×Lodding buffer,150 V恆壓2 h。
4.銀染:(1)固定：膠在10%冰乙酸中，洗1次。(2)銀染：0.2%AgNO3 300 ml，加入0.5 ml甲醛，染色10 min，洗1次。(3)顯色：3%Na2CO3 300 ml,加甲醛0.5 ml，顯色至清晰。(4)終止：10%冰乙酸300 ml，終止顯色。
二、結果
用非核素TRAP-銀染端粒酶活性檢測法 分析 45例手術標本，腦腫瘤陽性率為70.58%(12/17)，腸癌陽性率為84.62%(11/13)，食管癌陽性率為90%(9/10)，食管癌旁組織陽性率為90%(4/5)，用2種方法對15例標本對比檢測，TRAP-ELISA法檢出9例陽性，TRAP-銀染法檢出9例陽性 ，結果一致。
三、討論
端粒酶活性檢測常用Kim［1］的TRAP法，在PCR過程中摻入同位素標記α-32P dGTP/dCTP，產物聚丙烯醯胺凝膠電泳，放射自顯影顯示相差6個核苷酸的DNA ladder條帶，以判斷端粒酶活性。該方法敏感，已被國際上多家實驗室採用，但由於 應用 核素，造成檢測周期長(約7周)，污染環境，要求有特殊而專一的實驗室，使其 廣泛應用受到限制。為此，我們對Kim［1］的方法進行改進，建立了不需加入核素，直接進行RT-PCR擴增，產物電泳後硝酸銀染色，顯示DNA梯狀電泳帶的方法。同時應用保靈曼公司的TRAP-ELISA端粒酶活性半定量法，對照檢測。兩種方法對比檢測結果一致。說明我們的方法同樣敏感、準確，且簡便易推廣。
端粒是真核細胞染色體末端的「帽子」，由多拷貝串聯的6核苷酸5′TTAGGG3′重複序列和特異蛋白質結合構成，具有維持染色體末端穩定和遺傳信息不丟失的功能。按照DNA複製模型，DNA複製1次，母鏈5′端就有1段DNA無法拷貝到子鏈中去，將造成DNA鏈愈來愈短，遺傳信息丟失。真核生物線性DNA分子靠末端6核苷酸多拷貝序列(既端粒)和端粒酶的激活，保證遺傳信息複製時的完全性。細胞生命周期有限 ，染色體端粒隨細胞的分裂不斷丟失，當端粒長度減小到一定臨界值(2～4 kb)時，細胞即趨向衰老、死亡。端粒被認為是細胞有絲分裂的「生物鐘」［2］。有報道癌細胞和培養的永生化細胞有較短的端粒長度和較強的端粒酶活性，正常體細胞檢測不到端粒酶活性，而生殖細胞、胚胎細胞有端粒酶表達，可見端粒酶催化合成端粒的重複片段添加到端粒，對維持細胞端粒的動態平衡、保證細胞的分裂能力起重要作用［3，4］。我們檢測17例腦腫瘤中有13例腦膠質瘤、10例端粒酶陽性，其中惡性程度低的星形細胞瘤Ⅱ級標本中端粒酶陽性率為40%(2/5)，而低分化的惡性星形細胞瘤Ⅲ和Ⅳ級端粒酶陽性率為100%(8/8)，經χ2檢驗二者差異有顯著性(P＜0.05)。同樣，13例腸癌標本中，高分化腺癌Ⅰ級陽性率為60%(3/5)，低分化腺癌Ⅱ級陽性率為100%(8/8)，說明隨腫瘤惡性程度升高，其端粒酶活性表達率升高，對判斷腫瘤惡性程度及預後有重要意義。
一、材料與方法
1.總蛋白提取：手術後取下的活組織，液氮保存。(1)100 ml提取液中含10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA,0.5 mmol/L β-巰基乙醇；0.5% CHAPS，體積分數為10%的甘油。(2)組織中提取總蛋白：取約30 mg組織用無菌眼科手術剪儘量剪碎，加入200 μl提取液，冰浴30 min後，4 ℃ 1 600 g離心20 min。吸取上清約150 μl待測。
2.TRAP反應：(1)引物及稀釋：RNA模板逆轉錄引物TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′18mer，MW=5 524，濃度為0.541 g/L。PCR引物CX：5′-CCTTACCCTTACCCTTACCC
TAA3′24mer,MW=7 104,濃度為0.688 g/L。(2)PCR擴增：①將Kim［1］的方法改進為：50 μl PCR液含20 mmol/L Tris-HCl (pH8.3);1.5 mmol/L MgCl2;63 mmol/L KCl;0.005%Tween-20;1 mmol/L EGTA;200 μmmol/L dNTP;0.1 μgT4 g32 蛋白;0.1 μg/L牛血清白蛋白;0.1 μg TS引物;2 U Taqase;0.5～1.0 mg總蛋白。②25℃ 20 min，加入0.1 μg CX引物。③94℃預變性5 min，94℃30 s→50℃ s→72℃90 s 30個循壞，72℃延伸10 min。
3.電泳:12%非變性聚丙烯醯胺凝膠，取10 μl PCR產物，加2 μl 6×Lodding buffer,150 V恆壓2 h。
4.銀染:(1)固定：膠在10%冰乙酸中，洗1次。(2)銀染：0.2%AgNO3 300 ml，加入0.5 ml甲醛，染色10 min，洗1次。(3)顯色：3%Na2CO3 300 ml,加甲醛0.5 ml，顯色至清晰。(4)終止：10%冰乙酸300 ml，終止顯色。
二、結果
用非核素TRAP-銀染端粒酶活性檢測法 分析 45例手術標本，腦腫瘤陽性率為70.58%(12/17)，腸癌陽性率為84.62%(11/13)，食管癌陽性率為90%(9/10)，食管癌旁組織陽性率為90%(4/5)，用2種方法對15例標本對比檢測，TRAP-ELISA法檢出9例陽性，TRAP-銀染法檢出9例陽性 ，結果一致。
三、討論
端粒酶活性檢測常用Kim［1］的TRAP法，在PCR過程中摻入同位素標記α-32P dGTP/dCTP，產物聚丙烯醯胺凝膠電泳，放射自顯影顯示相差6個核苷酸的DNA ladder條帶，以判斷端粒酶活性。該方法敏感，已被國際上多家實驗室採用，但由於 應用 核素，造成檢測周期長(約7周)，污染環境，要求有特殊而專一的實驗室，使其 廣泛應用受到限制。為此，我們對Kim［1］的方法進行改進，建立了不需加入核素，直接進行RT-PCR擴增，產物電泳後硝酸銀染色，顯示DNA梯狀電泳帶的方法。同時應用保靈曼公司的TRAP-ELISA端粒酶活性半定量法，對照檢測。兩種方法對比檢測結果一致。說明我們的方法同樣敏感、準確，且簡便易推廣。
端粒是真核細胞染色體末端的「帽子」，由多拷貝串聯的6核苷酸5′TTAGGG3′重複序列和特異蛋白質結合構成，具有維持染色體末端穩定和遺傳信息不丟失的功能。按照DNA複製模型，DNA複製1次，母鏈5′端就有1段DNA無法拷貝到子鏈中去，將造成DNA鏈愈來愈短，遺傳信息丟失。真核生物線性DNA分子靠末端6核苷酸多拷貝序列(既端粒)和端粒酶的激活，保證遺傳信息複製時的完全性。細胞生命周期有限 ，染色體端粒隨細胞的分裂不斷丟失，當端粒長度減小到一定臨界值(2～4 kb)時，細胞即趨向衰老、死亡。端粒被認為是細胞有絲分裂的「生物鐘」［2］。有報道癌細胞和培養的永生化細胞有較短的端粒長度和較強的端粒酶活性，正常體細胞檢測不到端粒酶活性，而生殖細胞、胚胎細胞有端粒酶表達，可見端粒酶催化合成端粒的重複片段添加到端粒，對維持細胞端粒的動態平衡、保證細胞的分裂能力起重要作用［3，4］。我們檢測17例腦腫瘤中有13例腦膠質瘤、10例端粒酶陽性，其中惡性程度低的星形細胞瘤Ⅱ級標本中端粒酶陽性率為40%(2/5)，而低分化的惡性星形細胞瘤Ⅲ和Ⅳ級端粒酶陽性率為100%(8/8)，經χ2檢驗二者差異有顯著性(P＜0.05)。同樣，13例腸癌標本中，高分化腺癌Ⅰ級陽性率為60%(3/5)，低分化腺癌Ⅱ級陽性率為100%(8/8)，說明隨腫瘤惡性程度升高，其端粒酶活性表達率升高，對判斷腫瘤惡性程度及預後有重要意義。
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