【摘要】 C型肝炎是由C型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV )感染而引起的嚴重威脅人類健康的傳染病， 目前 還沒有研製成功有效的疫苗。HCV-E1包膜糖蛋白是HCV的結構蛋白之一,具有重要的受體結合位點和抗原表位,在病毒感染和宿主免疫過程中起著十分重要的作用。其分子和功能特性的 研究 對HCV預防和 治療 的研究有重要意義。近年來, 有關E1蛋白在機體的免疫應答及其在疫苗研製方面的作用取得了一定的進展, 本文就此做一綜述。
【關鍵詞】 C型肝炎;C肝病毒；包膜蛋白E1；疫苗
Advances research on HCV E1 envelope protEin
【Abstract】 Hepatitis C,caused by hepatitis C virus(HCV),is an important infectious disease threatening human health,and at present,there are no vaccines available for preventing HCV infection. The E1 envelope protein is one of the structural protein of HCV,having important receptor binding site and epitope,it play important role in the process of viral infection and immunity.The study of molecular and functional character is significance for development of prophylactic and therapeutic vaccines against hepatitis C virus.Recent years,knowledge of the E1 protein,immune response in the organism,as well as the study of vaccine,has progressed substantially.Here the advances of studies on the E1 protein are reviewed.
【Key words】 hepatitis C;hepatitis C virus;E1 envelope protein;vaccine
C型肝炎是由C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)引起的慢性傳染性疾病。目前全球HCV感染者約有1.7～2.0億，我國約3800萬人感染HCV。超過60%的HCV感染者可 發展 為慢性感染，而慢性HCV感染與肝硬化和肝癌直接相關。在美國、澳大利亞等西方國家，慢性HCV感染已是終末期肝病的首位病因。目前首選的治療 方法 是聯合聚乙二醇化的IFN-a與利巴韋林，但僅在40%～50%的感染者有較好的應答，徹底清除病毒者更為鮮見［1～3］。除了肝功能障礙的症狀以外,HCV 感染常和多種自身免疫性疾病以及非柯傑金氏淋巴瘤等有關,對生活質量構成嚴重 影響 ［4］。
由於HCV至少存在6種不同基因型，包膜糖蛋白(E1、 E2)有很高的突變率，HCV體外複製能力差，缺乏較敏感的組織培養方法，理想的動物模型亦難尋找，迄今為止，除黑猩猩之外，還未發現其他任何一種理想的HCV易感動物模型［5］。這對全面認識HCV的免疫清除機制以及評價疫苗的免疫效果均造成極大困難。這些因素使HCV疫苗研製面臨巨大挑戰。儘管如此，各國有關學者仍在不斷探索，在HCV疫苗研製方面積累了較多研究資料，為最終成功地研製HCV疫苗奠定了基礎。本文主要就HCV包膜糖蛋白E1方面的研究進展作一綜述。
1 HCV基因組的結構及其作用機制
1.1 基因組結構 C型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約9.5 kb，編碼一個開放閱讀框架，翻譯成一個多聚蛋白前體，該前體蛋白被宿主信號肽酶和病毒自身蛋白酶加工為3種結構蛋白(核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2)和7種非結構蛋白(p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b)。
1.2 包膜蛋白的結構及其作用機制 HCV結構蛋白(C,El和E2)在宿主內質網信號肽酶的作用下，裂解出El和E2蛋白。HCV El和E2蛋白高度糖基化，且羧基末端都有一個疏水區域，依此錨定於細胞質膜。HCV-E1蛋白含有192個胺基酸,含5～6個N-糖基化位點，是屬於I型內源性糖基化蛋白［7］。E1糖基化後分子量約為30～35kD，脫糖基後為21kD。E1和E2糖蛋白構成HCV的包膜蛋白,是病毒的重要組成部分,該包膜蛋白部分或全部位於病毒顆粒表面並含有重要的中和性抗原表位,但其變異較大［6］。E1通過N末端與Core蛋白結合,也可以與NS2蛋白相互作用［8］，在病毒生命周期中起著重要的作用。E1和E2通過非共價鍵形成異源性二聚體,共同組成HCV病毒粒子的包膜, 其與病毒吸附和進入靶細胞過程有重要關係，因此,包膜蛋白普遍認為是疫苗研究的靶標［9］。
對HCV包膜蛋白天然構象的研究發現，El和E2之間可通過共價鍵相連，構成異源二聚體，如同是HCV病毒顆粒的功能亞單位。Deleersnyde等［10］人用構象敏感性MAbs作免疫沉澱試驗對其特性作了進一步研究，並在 電子 顯微鏡下作了觀察。免疫電鏡下可觀察到包膜糖蛋白定位在內質網膜上，說明HCV包膜的獲得是在內質網膜萌出的過程中實現的，這一點與其他被膜病毒也完全一致。從內質網萌出後，HCV可通過細胞分泌途徑或在細胞溶解過程中從感染細胞中釋放出來［11］。可見HCV就像黃病毒的其他成員一樣，其形態結構的形成源於細胞內結構而非來自外膜。實驗中，當表達於哺乳動物細胞時，只有一部分EIE2正確摺疊，正確摺疊的EIE2糖蛋白即形成異源二聚體，其餘部分則由於錯誤摺疊形成二硫鍵連接的聚合體，不能通過分泌途逕到達細胞膜表面。
2 E1蛋白在入胞過程中的作用
病毒表面糖蛋白介導病毒進入靶細胞的過程首先需要病毒與宿主細胞表面受體結合, 接著是病毒和細胞膜的融合, 如流感病毒、黃病毒、蜱體腦炎病毒等。然而,HCV 進入靶細胞的過程還不清楚。1996年,Rosa等［12］發現哺乳動物細胞表達的重組E2或E1/E2蛋白免疫黑猩猩，對同源HCV攻擊有保護作用,表明E1在病毒吸附靶細胞過程中具有重要作用，同時提示靶細胞表面存在能與E1結合的結構。
Lagging等［13］發現HCV-DNA疫苗免疫接種BALB/c小鼠後,可誘導BALB/c小鼠產生強烈的體液免疫應答,將HCV的E1(192aa～383aa)和E2(384aa～809aa)區與皰疹病毒G蛋白的跨膜區和胞質尾區構建成嵌合基因,在轉化細胞中可組裝成假型病毒(VSV/HCV)，該假病毒可以感染真核細胞;然後用同源性HCV分離株的包膜糖蛋白免疫黑猩猩獲得的免疫血清在體外進行中和實驗,發現抗血清可以阻斷假型病毒對細胞的感染,提示E1在假型病毒感染真核細胞中起著重要作用。研究表明［14］，在HCV E1基因的原核表達中，由於E1蛋白C末端的跨膜區（TM）與大腸桿菌的細胞膜相互作用而改變其通透性，導致細菌細胞的溶解、死亡，因此，E1 TM區的「膜激活」特性是HCV E1基因難於在原核系統中完全表達的原因。由此推測，HCV-E1蛋白可能對於病毒的脫殼、進入細胞、與內質網膜結合等病毒-細胞的相互作用中起重要作用，HCV E1的研究對闡明HCV的致病機理將會有重要意義。
3 E1與機體的免疫反應（E1的免疫學表位）
HCV 感染宿主後,宿主首先接觸的是包膜蛋白,該蛋白對於宿主產生體液免疫反應很重要，同時宿主的保護性免疫常依賴於針對病毒表面蛋白的抗體，該抗體能阻斷病毒與敏感細胞的結合，並通過加強細胞免疫清除病毒，因此研究針對HCV包膜糖蛋白的體液免疫具有重要意義。由於HCV沒有其他動物模型，有關HCV感染天然體液免疫反應的研究，只能在HCV感染者中進行。根據外膜區的胺基酸序列，合成一系列相互重疊的多肽作為抗原，通過和病人進行反應，可以篩選到外膜區的抗原表位。Ray等用這種方法研究表明［15］，在E1區存在兩段潛在的抗原表位，P1：210～223，P2：315～327，P1位於變異較大的區域，P2位於高度保守的區域，在38份感染者血清標本中，有35份（92%）與P2反應，僅17份（44 .7%）與P1反應。而Keck ZY等［16］ 在對抗HCV單克隆抗體的篩選中，發現單抗H111可識別E1/N端序列「YEVRNVSGVYH」，並發現該單抗可以阻斷病毒對敏感細胞的吸附和感染，進一步研究發現這種中和活性對基因型1a,1b,2b和3a均有交叉中和性，推測這個區域可能是一個高度保守的中和性抗原表位。
4 E1糖蛋白和HCV疫苗的研究
目前認為，理想的HCV疫苗應具有雙重功能:(1)可產生交叉活性的體液免疫反應以中和大多感染的病毒株;(2)並可建立強大的CTL免疫，清除那些逃過抗體中和反應的病毒株的進一步傳播［17］。
在早期的研究中，以真核表達E1/E2免疫原為主，Ralston等［18］用重組痘苗病毒載體轉染哺乳動物細胞地表達了HCV全長結構蛋白，發現雖可獲得高效表達，所表達的E1和E2包膜糖蛋白易形成復合物。用純化的包膜糖蛋白的E1E2復合物免疫黑猩猩可產生高滴度的抗E1和E2抗體。而 應用 E1包膜糖蛋白僅能刺激機體產生弱的免疫反應，提示E1\\E2包膜糖蛋白形成的異源二聚體可能對激發強免疫應答是必要的。
1994年，Choo等［19］ 報道了用真核表達的重組HCV包膜蛋白E1(gp33)和E2 (gp72)免疫接種黑猩猩的研究。他們用重組痘苗病毒為載體，在Hela細胞中表達HCV包膜糖蛋白E1和E2,加佐劑製成HCV疫苗，在0、1、7月份對7隻黑猩猩進行免疫，均產生了抗E1、抗E2抗體，而且效價高於慢性HCV感染者，在最後一次加強免疫後2～3周，用約10個CID50的HCV由靜脈攻擊動物，5隻對照組黑猩猩均發生了HCV感染，而7隻免疫動物中有5隻獲得了完全性保護，另2隻抗HCV-E抗體效價<15000的黑猩猩，雖呈一過性HCV感染，表現為血清HCV RNA短暫陽性和丙氨酸轉氨酶值一過性升高，但沒有轉化為慢性感染。說明真核表達的可溶性重組抗原不單具有良好的免疫原性，而且確可激發中和性的免疫反應。
隨後，人們開始進行原核表達E1蛋白免疫原性的研究，徐進平等［20］在原核系統中高效表達的全長HCV E1蛋白,經純化後免疫小鼠和家兔後,E1蛋白也可誘生較高水平的特異性體液免疫應答。小鼠和兔抗E1 IgG抗體水平在第8周達到高峰,且兔的應答水平較小鼠維持更好，說明原核表達的HCV E1融合蛋白具有良好的免疫原性,能誘導免疫實驗動物產生特異性的體液免疫應答。同時,小鼠CD8+T細胞數量在免疫後有明顯升高，提示E1包涵體蛋白能誘發較高水平的細胞免疫應答。原核表達的HCV E1蛋白為非糖基化蛋白,並形成包涵體，用E1包涵體蛋白免疫小鼠和兔能誘發較高水平的特異性體液免疫應答和細胞免疫應答，推測E1糖基化並不是其具有免疫原性所必須的。一般而言，用可溶性蛋白質免疫原,誘導機體體液免疫的效果是很好的,但對提高機體細胞免疫效果往往不顯著。HCV E1包涵體抗原呈現良好的體液免疫和細胞免疫效果，推測這種包涵體結構作為抗原不同於可溶性蛋白,包涵體進入機體後可被細胞吞噬，然後在細胞內緩慢溶解, 產生類似DNA疫苗的效果，有利於E1抗原通過內源性抗原呈遞途徑,激活CTL反應。我國上海生化所分別克隆了192～340aa和192～383aa兩個片段，在E.Coli中，前者獲得了表達，後者不表達。表達產物經純化，用WB檢測，可以和用哺乳動物細胞表達的E1免疫後產生的抗體發生交叉反應。由此推斷，原核表達的抗原和真核表達的抗原享有同樣的抗原性［21］。
【關鍵詞】 C型肝炎;C肝病毒；包膜蛋白E1；疫苗
Advances research on HCV E1 envelope protEin
【Abstract】 Hepatitis C,caused by hepatitis C virus(HCV),is an important infectious disease threatening human health,and at present,there are no vaccines available for preventing HCV infection. The E1 envelope protein is one of the structural protein of HCV,having important receptor binding site and epitope,it play important role in the process of viral infection and immunity.The study of molecular and functional character is significance for development of prophylactic and therapeutic vaccines against hepatitis C virus.Recent years,knowledge of the E1 protein,immune response in the organism,as well as the study of vaccine,has progressed substantially.Here the advances of studies on the E1 protein are reviewed.
【Key words】 hepatitis C;hepatitis C virus;E1 envelope protein;vaccine
C型肝炎是由C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)引起的慢性傳染性疾病。目前全球HCV感染者約有1.7～2.0億，我國約3800萬人感染HCV。超過60%的HCV感染者可 發展 為慢性感染，而慢性HCV感染與肝硬化和肝癌直接相關。在美國、澳大利亞等西方國家，慢性HCV感染已是終末期肝病的首位病因。目前首選的治療 方法 是聯合聚乙二醇化的IFN-a與利巴韋林，但僅在40%～50%的感染者有較好的應答，徹底清除病毒者更為鮮見［1～3］。除了肝功能障礙的症狀以外,HCV 感染常和多種自身免疫性疾病以及非柯傑金氏淋巴瘤等有關,對生活質量構成嚴重 影響 ［4］。
由於HCV至少存在6種不同基因型，包膜糖蛋白(E1、 E2)有很高的突變率，HCV體外複製能力差，缺乏較敏感的組織培養方法，理想的動物模型亦難尋找，迄今為止，除黑猩猩之外，還未發現其他任何一種理想的HCV易感動物模型［5］。這對全面認識HCV的免疫清除機制以及評價疫苗的免疫效果均造成極大困難。這些因素使HCV疫苗研製面臨巨大挑戰。儘管如此，各國有關學者仍在不斷探索，在HCV疫苗研製方面積累了較多研究資料，為最終成功地研製HCV疫苗奠定了基礎。本文主要就HCV包膜糖蛋白E1方面的研究進展作一綜述。
1 HCV基因組的結構及其作用機制
1.1 基因組結構 C型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約9.5 kb，編碼一個開放閱讀框架，翻譯成一個多聚蛋白前體，該前體蛋白被宿主信號肽酶和病毒自身蛋白酶加工為3種結構蛋白(核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2)和7種非結構蛋白(p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b)。
1.2 包膜蛋白的結構及其作用機制 HCV結構蛋白(C,El和E2)在宿主內質網信號肽酶的作用下，裂解出El和E2蛋白。HCV El和E2蛋白高度糖基化，且羧基末端都有一個疏水區域，依此錨定於細胞質膜。HCV-E1蛋白含有192個胺基酸,含5～6個N-糖基化位點，是屬於I型內源性糖基化蛋白［7］。E1糖基化後分子量約為30～35kD，脫糖基後為21kD。E1和E2糖蛋白構成HCV的包膜蛋白,是病毒的重要組成部分,該包膜蛋白部分或全部位於病毒顆粒表面並含有重要的中和性抗原表位,但其變異較大［6］。E1通過N末端與Core蛋白結合,也可以與NS2蛋白相互作用［8］，在病毒生命周期中起著重要的作用。E1和E2通過非共價鍵形成異源性二聚體,共同組成HCV病毒粒子的包膜, 其與病毒吸附和進入靶細胞過程有重要關係，因此,包膜蛋白普遍認為是疫苗研究的靶標［9］。
對HCV包膜蛋白天然構象的研究發現，El和E2之間可通過共價鍵相連，構成異源二聚體，如同是HCV病毒顆粒的功能亞單位。Deleersnyde等［10］人用構象敏感性MAbs作免疫沉澱試驗對其特性作了進一步研究，並在 電子 顯微鏡下作了觀察。免疫電鏡下可觀察到包膜糖蛋白定位在內質網膜上，說明HCV包膜的獲得是在內質網膜萌出的過程中實現的，這一點與其他被膜病毒也完全一致。從內質網萌出後，HCV可通過細胞分泌途徑或在細胞溶解過程中從感染細胞中釋放出來［11］。可見HCV就像黃病毒的其他成員一樣，其形態結構的形成源於細胞內結構而非來自外膜。實驗中，當表達於哺乳動物細胞時，只有一部分EIE2正確摺疊，正確摺疊的EIE2糖蛋白即形成異源二聚體，其餘部分則由於錯誤摺疊形成二硫鍵連接的聚合體，不能通過分泌途逕到達細胞膜表面。
2 E1蛋白在入胞過程中的作用
病毒表面糖蛋白介導病毒進入靶細胞的過程首先需要病毒與宿主細胞表面受體結合, 接著是病毒和細胞膜的融合, 如流感病毒、黃病毒、蜱體腦炎病毒等。然而,HCV 進入靶細胞的過程還不清楚。1996年,Rosa等［12］發現哺乳動物細胞表達的重組E2或E1/E2蛋白免疫黑猩猩，對同源HCV攻擊有保護作用,表明E1在病毒吸附靶細胞過程中具有重要作用，同時提示靶細胞表面存在能與E1結合的結構。
Lagging等［13］發現HCV-DNA疫苗免疫接種BALB/c小鼠後,可誘導BALB/c小鼠產生強烈的體液免疫應答,將HCV的E1(192aa～383aa)和E2(384aa～809aa)區與皰疹病毒G蛋白的跨膜區和胞質尾區構建成嵌合基因,在轉化細胞中可組裝成假型病毒(VSV/HCV)，該假病毒可以感染真核細胞;然後用同源性HCV分離株的包膜糖蛋白免疫黑猩猩獲得的免疫血清在體外進行中和實驗,發現抗血清可以阻斷假型病毒對細胞的感染,提示E1在假型病毒感染真核細胞中起著重要作用。研究表明［14］，在HCV E1基因的原核表達中，由於E1蛋白C末端的跨膜區（TM）與大腸桿菌的細胞膜相互作用而改變其通透性，導致細菌細胞的溶解、死亡，因此，E1 TM區的「膜激活」特性是HCV E1基因難於在原核系統中完全表達的原因。由此推測，HCV-E1蛋白可能對於病毒的脫殼、進入細胞、與內質網膜結合等病毒-細胞的相互作用中起重要作用，HCV E1的研究對闡明HCV的致病機理將會有重要意義。
3 E1與機體的免疫反應（E1的免疫學表位）
HCV 感染宿主後,宿主首先接觸的是包膜蛋白,該蛋白對於宿主產生體液免疫反應很重要，同時宿主的保護性免疫常依賴於針對病毒表面蛋白的抗體，該抗體能阻斷病毒與敏感細胞的結合，並通過加強細胞免疫清除病毒，因此研究針對HCV包膜糖蛋白的體液免疫具有重要意義。由於HCV沒有其他動物模型，有關HCV感染天然體液免疫反應的研究，只能在HCV感染者中進行。根據外膜區的胺基酸序列，合成一系列相互重疊的多肽作為抗原，通過和病人進行反應，可以篩選到外膜區的抗原表位。Ray等用這種方法研究表明［15］，在E1區存在兩段潛在的抗原表位，P1：210～223，P2：315～327，P1位於變異較大的區域，P2位於高度保守的區域，在38份感染者血清標本中，有35份（92%）與P2反應，僅17份（44 .7%）與P1反應。而Keck ZY等［16］ 在對抗HCV單克隆抗體的篩選中，發現單抗H111可識別E1/N端序列「YEVRNVSGVYH」，並發現該單抗可以阻斷病毒對敏感細胞的吸附和感染，進一步研究發現這種中和活性對基因型1a,1b,2b和3a均有交叉中和性，推測這個區域可能是一個高度保守的中和性抗原表位。
4 E1糖蛋白和HCV疫苗的研究
目前認為，理想的HCV疫苗應具有雙重功能:(1)可產生交叉活性的體液免疫反應以中和大多感染的病毒株;(2)並可建立強大的CTL免疫，清除那些逃過抗體中和反應的病毒株的進一步傳播［17］。
在早期的研究中，以真核表達E1/E2免疫原為主，Ralston等［18］用重組痘苗病毒載體轉染哺乳動物細胞地表達了HCV全長結構蛋白，發現雖可獲得高效表達，所表達的E1和E2包膜糖蛋白易形成復合物。用純化的包膜糖蛋白的E1E2復合物免疫黑猩猩可產生高滴度的抗E1和E2抗體。而 應用 E1包膜糖蛋白僅能刺激機體產生弱的免疫反應，提示E1\\E2包膜糖蛋白形成的異源二聚體可能對激發強免疫應答是必要的。
1994年，Choo等［19］ 報道了用真核表達的重組HCV包膜蛋白E1(gp33)和E2 (gp72)免疫接種黑猩猩的研究。他們用重組痘苗病毒為載體，在Hela細胞中表達HCV包膜糖蛋白E1和E2,加佐劑製成HCV疫苗，在0、1、7月份對7隻黑猩猩進行免疫，均產生了抗E1、抗E2抗體，而且效價高於慢性HCV感染者，在最後一次加強免疫後2～3周，用約10個CID50的HCV由靜脈攻擊動物，5隻對照組黑猩猩均發生了HCV感染，而7隻免疫動物中有5隻獲得了完全性保護，另2隻抗HCV-E抗體效價<15000的黑猩猩，雖呈一過性HCV感染，表現為血清HCV RNA短暫陽性和丙氨酸轉氨酶值一過性升高，但沒有轉化為慢性感染。說明真核表達的可溶性重組抗原不單具有良好的免疫原性，而且確可激發中和性的免疫反應。
隨後，人們開始進行原核表達E1蛋白免疫原性的研究，徐進平等［20］在原核系統中高效表達的全長HCV E1蛋白,經純化後免疫小鼠和家兔後,E1蛋白也可誘生較高水平的特異性體液免疫應答。小鼠和兔抗E1 IgG抗體水平在第8周達到高峰,且兔的應答水平較小鼠維持更好，說明原核表達的HCV E1融合蛋白具有良好的免疫原性,能誘導免疫實驗動物產生特異性的體液免疫應答。同時,小鼠CD8+T細胞數量在免疫後有明顯升高，提示E1包涵體蛋白能誘發較高水平的細胞免疫應答。原核表達的HCV E1蛋白為非糖基化蛋白,並形成包涵體，用E1包涵體蛋白免疫小鼠和兔能誘發較高水平的特異性體液免疫應答和細胞免疫應答，推測E1糖基化並不是其具有免疫原性所必須的。一般而言，用可溶性蛋白質免疫原,誘導機體體液免疫的效果是很好的,但對提高機體細胞免疫效果往往不顯著。HCV E1包涵體抗原呈現良好的體液免疫和細胞免疫效果，推測這種包涵體結構作為抗原不同於可溶性蛋白,包涵體進入機體後可被細胞吞噬，然後在細胞內緩慢溶解, 產生類似DNA疫苗的效果，有利於E1抗原通過內源性抗原呈遞途徑,激活CTL反應。我國上海生化所分別克隆了192～340aa和192～383aa兩個片段，在E.Coli中，前者獲得了表達，後者不表達。表達產物經純化，用WB檢測，可以和用哺乳動物細胞表達的E1免疫後產生的抗體發生交叉反應。由此推斷，原核表達的抗原和真核表達的抗原享有同樣的抗原性［21］。
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