作者：韋星，萬福生，塗碩，余樂涵，楊香生
【關鍵詞】花邊蓮；,,SPC
摘要：目的探討花邊蓮提取液對人肺癌SPCA1細胞凋亡相關基因survivin和caspase3表達的 影響 。 方法 採用體外培養人肺癌SPCA1細胞，實驗隨機分為正常對照組、花邊蓮處理組（濃度分別為12.5，25和50 ml/L）和順鉑（DDp25 mg/L）組，半定量RTPCR檢測survivin和caspase3 mRNA表達水平，二步法免疫組化檢測Survivin和Caspase3蛋白表達變化。結果與正常對照組相比，花邊蓮各濃度組caspase3 mRNA和蛋白表達顯著上升（P＜0.01），survivin mRNA和蛋白表達明顯下降（P＜0.01）。結論 花邊蓮提取液誘導SPCA1細胞凋亡的分子機理可能與上調caspase3基因表達和下調survivin基因表達有關。
關鍵詞：花邊蓮； SPCA1細胞； 細胞凋亡； survivin; caspase3
Influence of HuaBianLian Extract on Expression of Apoptosis Associated Genes Survivin and Caspase3 in Human Lung Cancer SPCA1 Cells
Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of HuaBianLian(HBL) extract on expression of apoptosis associated genes survivin and caspase3 in human lung cancer SPCA1 cells.MethodsCultured human lung cancer SPCA1 cells were randomly divided into the control group (the negative control group),HBL-treated groups(12.5,2.5,50 ml/L) and DDP(25 mg/L) group (the positive control group). The expression of survivin and caspase3 mRNA was detected by semiquantitive RTPCR .The expression of survivin and caspase-3 protEins were detected by twostep immunhistochemical staining.ResultsCompared with control group ,the expression of caspase 3 mRNA and protEIn increased significanty (P＜0.01),while survivin mRNA and protein decreased markedly in HBL groups (P＜0.01).ConclusionThe molecular mechanism of HBL apoptosis inducing of SPCA1 cells may be associated with the upregulating expression of caspase-3 gene and downregulating expression of survivin gene.
Key words：HuaBianLian; SPCA1 cells; Apoptosis; Survivin gene; Caspase3 gene
前期 研究 表明，中藥復方花邊蓮HuaBianLian, HBL提取液對人肺癌SPCA1細胞具有較強的增殖抑制和誘導細胞凋亡作用［1］，但其作用機理尚不明確。大量研究證據表明，細胞凋亡調節機理是多種基因互相作用、綜合調節的結果。生存素（Survivin）是最近發現的凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein,IAP），它通過直接作用於細胞凋亡途徑中的終末效應酶半胱氨酸蛋白酶Caspase3和Caspase7阻斷細胞凋亡途徑［2］。Caspase3與凋亡關係最為密切，參與多種因素誘導的細胞凋亡。本實驗觀察HBL提取液對人肺癌SPCA1細胞凋亡相關基因survivin和caspase3表達變化的影響，探討該藥方抗腫瘤作用的可能分子機理。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞人肺癌SPCA1細胞株由中科院上海細胞生物研究所細胞庫提供。
1.1.2 試劑與儀器胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養基為GIBCO公司產品，順鉑（DDP）為錦州九泰藥業有限責任公司產品，RNA提取試劑盒為BIODEVTECH公司產品，Access RTPCR system為Promega公司產品，PCR引物為上海生工生物工程公司合成，鼠抗survivin(D8)：sc 17779和caspase3(E8)：sc7272單克隆抗體為Santa cruz公司產品，PowerVisionTM免疫組化檢測試劑（PV6001/6002）為北京中杉金橋生物技術公司產品。倒置顯微鏡（Cioc），BX51型顯微鏡（OLYMPUS），PCR儀（杭州郎基）。
1.2 方法
1.2.1 HBL提取液的製備取白花蛇舌草、半枝蓮、半邊蓮和白英等（購買於江西南華醫藥有限公司中藥材分公司，產地江西）干品100 g，用1 000 ml水浸泡1 h，加熱煮沸後小火煎熬60 min，室溫冷卻，120目網篩過濾，棄藥渣，濾液離心（3 000 r/min，20 min），2次。取上清液，濃縮至50 ml，調pH值為7.0～7.2，0.22 μm過濾除菌，獲生藥含量為2.0 g/ml白英水提液，5 ml小瓶分裝，-20℃保存備用，實驗時將含10%胎牛血清RPMI 1640培養液稀釋至所需的藥物濃度。
1.2.2 細胞培養和藥物處理SPCA1細胞，以含100 U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、10%FBS的RPMI 1640培養液，在37℃，5%CO2的培養箱中培養，細胞生長至對數增殖期，更換含0，12.5，25，50 ml/L HBL新鮮培養液，用DDP（25 mg/L）為陽性對照組，藥物作用時間為48 h。
1.2.3 半定量RTPCR檢測survivin和casapse-3 mRNA表達藥物處理細胞48 h後，收集各組細胞，PBS沖洗兩次，按總RNA提取試劑盒的說明書提取RNA。引物藉助primer premier 5.0軟體設計，並經Genebank驗證。survivin引物：Sense：5』TCTCAAGGA CCA CCG CAT CT3』，Anti-sese：5』GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA3』，擴增產物長度289 bp；caspase-3引物：Sense:5』-GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA-3』，Anti-sese:5』ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG3』,擴增產物長度270 bp;β-actub引物：Sense：5』-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3』，Antisense：5'AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT -3'，擴增產物長度621bp。按試劑盒說明採用一步法進行RTPCR。反應體系總體積50 μl，逆轉錄45℃×45 min，AMV RT滅活和預變性94℃×2 min，然後進行PCR 35個循環（94℃×30 s，55℃×1 min，72℃×2 min），最後延伸72℃×7 min，終止於4℃。各取PCR產物10 μl,加溴酚藍指示劑2 μl，於1.5%瓊脂糖凝膠上電泳約1 h（電壓90 V），然後用紫外透射 分析 儀觀察結果並拍照，並通過凝膠圖像密度掃描儀掃描分析各條帶的光密度，以 βactin 的表達量為對照 計算 並比較各組survivin 和caspase3的相對表達量。
1.2.4 免疫組化法檢測Survivin和Caspase3蛋白表達按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作：藥物處理細胞48 h後，收集各組細胞，PBS沖洗兩次，製成細胞懸液塗片，風乾後丙酮固定15 min；3%過氧化氫孵育5 min，以阻斷內源性過氧化物酶；滴加一抗（稀釋1∶100），室溫90 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴比IgG抗體HRP多聚體20～30 min。以PBS沖洗，2 min×3次；以PBS代替一抗作為陰性對照。結果分析：Survivin和Caspase3蛋白定位於胞漿，細胞漿染為棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。利用CMLAS彩色病理圖像分析系統（北京航空大學空軍總 醫院 研製）進行分析。隨機計數低倍鏡下10個視野中的陽性細胞占該視野細胞總數的比率，得出每組細胞的陽性率。
1.2.5 統計學方法實驗數據採用±s表示，用SPSS10.0統計軟體進行統計學處理，參數統計採用t檢驗。
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【關鍵詞】花邊蓮；,,SPC
摘要：目的探討花邊蓮提取液對人肺癌SPCA1細胞凋亡相關基因survivin和caspase3表達的 影響 。 方法 採用體外培養人肺癌SPCA1細胞，實驗隨機分為正常對照組、花邊蓮處理組（濃度分別為12.5，25和50 ml/L）和順鉑（DDp25 mg/L）組，半定量RTPCR檢測survivin和caspase3 mRNA表達水平，二步法免疫組化檢測Survivin和Caspase3蛋白表達變化。結果與正常對照組相比，花邊蓮各濃度組caspase3 mRNA和蛋白表達顯著上升（P＜0.01），survivin mRNA和蛋白表達明顯下降（P＜0.01）。結論 花邊蓮提取液誘導SPCA1細胞凋亡的分子機理可能與上調caspase3基因表達和下調survivin基因表達有關。
關鍵詞：花邊蓮； SPCA1細胞； 細胞凋亡； survivin; caspase3
Influence of HuaBianLian Extract on Expression of Apoptosis Associated Genes Survivin and Caspase3 in Human Lung Cancer SPCA1 Cells
Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of HuaBianLian(HBL) extract on expression of apoptosis associated genes survivin and caspase3 in human lung cancer SPCA1 cells.MethodsCultured human lung cancer SPCA1 cells were randomly divided into the control group (the negative control group),HBL-treated groups(12.5,2.5,50 ml/L) and DDP(25 mg/L) group (the positive control group). The expression of survivin and caspase3 mRNA was detected by semiquantitive RTPCR .The expression of survivin and caspase-3 protEins were detected by twostep immunhistochemical staining.ResultsCompared with control group ,the expression of caspase 3 mRNA and protEIn increased significanty (P＜0.01),while survivin mRNA and protein decreased markedly in HBL groups (P＜0.01).ConclusionThe molecular mechanism of HBL apoptosis inducing of SPCA1 cells may be associated with the upregulating expression of caspase-3 gene and downregulating expression of survivin gene.
Key words：HuaBianLian; SPCA1 cells; Apoptosis; Survivin gene; Caspase3 gene
前期 研究 表明，中藥復方花邊蓮HuaBianLian, HBL提取液對人肺癌SPCA1細胞具有較強的增殖抑制和誘導細胞凋亡作用［1］，但其作用機理尚不明確。大量研究證據表明，細胞凋亡調節機理是多種基因互相作用、綜合調節的結果。生存素（Survivin）是最近發現的凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein,IAP），它通過直接作用於細胞凋亡途徑中的終末效應酶半胱氨酸蛋白酶Caspase3和Caspase7阻斷細胞凋亡途徑［2］。Caspase3與凋亡關係最為密切，參與多種因素誘導的細胞凋亡。本實驗觀察HBL提取液對人肺癌SPCA1細胞凋亡相關基因survivin和caspase3表達變化的影響，探討該藥方抗腫瘤作用的可能分子機理。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞人肺癌SPCA1細胞株由中科院上海細胞生物研究所細胞庫提供。
1.1.2 試劑與儀器胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養基為GIBCO公司產品，順鉑（DDP）為錦州九泰藥業有限責任公司產品，RNA提取試劑盒為BIODEVTECH公司產品，Access RTPCR system為Promega公司產品，PCR引物為上海生工生物工程公司合成，鼠抗survivin(D8)：sc 17779和caspase3(E8)：sc7272單克隆抗體為Santa cruz公司產品，PowerVisionTM免疫組化檢測試劑（PV6001/6002）為北京中杉金橋生物技術公司產品。倒置顯微鏡（Cioc），BX51型顯微鏡（OLYMPUS），PCR儀（杭州郎基）。
1.2 方法
1.2.1 HBL提取液的製備取白花蛇舌草、半枝蓮、半邊蓮和白英等（購買於江西南華醫藥有限公司中藥材分公司，產地江西）干品100 g，用1 000 ml水浸泡1 h，加熱煮沸後小火煎熬60 min，室溫冷卻，120目網篩過濾，棄藥渣，濾液離心（3 000 r/min，20 min），2次。取上清液，濃縮至50 ml，調pH值為7.0～7.2，0.22 μm過濾除菌，獲生藥含量為2.0 g/ml白英水提液，5 ml小瓶分裝，-20℃保存備用，實驗時將含10%胎牛血清RPMI 1640培養液稀釋至所需的藥物濃度。
1.2.2 細胞培養和藥物處理SPCA1細胞，以含100 U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、10%FBS的RPMI 1640培養液，在37℃，5%CO2的培養箱中培養，細胞生長至對數增殖期，更換含0，12.5，25，50 ml/L HBL新鮮培養液，用DDP（25 mg/L）為陽性對照組，藥物作用時間為48 h。
1.2.3 半定量RTPCR檢測survivin和casapse-3 mRNA表達藥物處理細胞48 h後，收集各組細胞，PBS沖洗兩次，按總RNA提取試劑盒的說明書提取RNA。引物藉助primer premier 5.0軟體設計，並經Genebank驗證。survivin引物：Sense：5』TCTCAAGGA CCA CCG CAT CT3』，Anti-sese：5』GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA3』，擴增產物長度289 bp；caspase-3引物：Sense:5』-GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA-3』，Anti-sese:5』ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG3』,擴增產物長度270 bp;β-actub引物：Sense：5』-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3』，Antisense：5'AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT -3'，擴增產物長度621bp。按試劑盒說明採用一步法進行RTPCR。反應體系總體積50 μl，逆轉錄45℃×45 min，AMV RT滅活和預變性94℃×2 min，然後進行PCR 35個循環（94℃×30 s，55℃×1 min，72℃×2 min），最後延伸72℃×7 min，終止於4℃。各取PCR產物10 μl,加溴酚藍指示劑2 μl，於1.5%瓊脂糖凝膠上電泳約1 h（電壓90 V），然後用紫外透射 分析 儀觀察結果並拍照，並通過凝膠圖像密度掃描儀掃描分析各條帶的光密度，以 βactin 的表達量為對照 計算 並比較各組survivin 和caspase3的相對表達量。
1.2.4 免疫組化法檢測Survivin和Caspase3蛋白表達按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作：藥物處理細胞48 h後，收集各組細胞，PBS沖洗兩次，製成細胞懸液塗片，風乾後丙酮固定15 min；3%過氧化氫孵育5 min，以阻斷內源性過氧化物酶；滴加一抗（稀釋1∶100），室溫90 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴比IgG抗體HRP多聚體20～30 min。以PBS沖洗，2 min×3次；以PBS代替一抗作為陰性對照。結果分析：Survivin和Caspase3蛋白定位於胞漿，細胞漿染為棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。利用CMLAS彩色病理圖像分析系統（北京航空大學空軍總 醫院 研製）進行分析。隨機計數低倍鏡下10個視野中的陽性細胞占該視野細胞總數的比率，得出每組細胞的陽性率。
1.2.5 統計學方法實驗數據採用±s表示，用SPSS10.0統計軟體進行統計學處理，參數統計採用t檢驗。
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