一例牛病毒性腹瀉病例的血清學診斷
牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）屬於黃病毒科，瘟病毒屬成員，主要引起牛病毒性腹瀉-黏膜病，造成患牛免疫耐受、持續性感染、母牛流產、死胎和畸形胎。20世紀40年代，在加拿大首次發現該論文聯盟http://wWW.LWlm.CoM病，之後向其他國產蔓延，目前該病呈世界性分布，給養牛業健康發展帶來了巨大障礙。為控制牛病毒性腹瀉病毒的傳播與蔓延，早期診斷是關鍵，本研究採用豬瘟膠體金快速檢測試紙卡檢測牛病毒性腹瀉抗體水平。
1 材料
30份疑似感染牛病毒性腹瀉病毒患牛的抗凝血。豬瘟病毒快速檢測試紙卡（貨號：M371328）購自克格儀器有限公司；牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測(血清) 試劑盒（貨號：99-43810）購自北京祥龍環宇生物技術有限公司。
2 方法
2.1 應用豬瘟膠體金快速檢測試紙卡檢測牛病毒性腹瀉抗體(血清)
2.1.1 操作步驟 從30份患牛抗凝血中分離血清，將分離的血清加入到豬瘟膠體金快速檢測試紙卡的檢測孔內，50ul/孔，放置於室溫中15min後，觀察反應結果。
2.1.2 判定方法 豬瘟膠體金快速檢測試紙卡T區（檢測線）呈現紫紅色，並且C區（對照線）也呈現紫紅色時，判定為陽性。當T區不變色，而C區呈現紫紅色，則判定為陰性。如果C區不呈現紫紅色時，此卡不能使用，為失效檢測卡。
2.2 應用牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測試劑盒檢測抗體(血清)
2.2.1 操作步驟
2.2.1.1 編號 將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔，空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同。
2.2.1.2 加樣 分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然後在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl。加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2.2.1.3 孵育 用封板膜封板後置37℃孵育30min。
2.2.1.4 洗滌 小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s後棄去，如此重複5次，拍干。
2.2.1.5 加酶 每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。孵育同2.2.1.3，洗滌同2.2.1.4。
2.2.1.6 顯色 每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色15min。
2.2.1.7 終止 每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。
2.2.1.8 測定結果 以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液後15min以內進行。
2.2.2 判定方法
2.2.2.1 試驗有效性 陽性對照孔平均值≥1.00；陰性對照平均值≤0.10。
2.2.2.2 臨界值(CUT OFF)計算 臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。
2.2.2.3 陰性判定 樣品OD值< 臨界值(CUT OFF)者為牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)陰性。
2.2.2.4 陽性判定 樣品OD值≥ 臨界值(CUT OFF)者為牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)陽性。
3 結果
用豬瘟膠體金快速檢測試紙卡和牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測試劑盒檢測30份患牛血清，牛病毒性腹瀉陽性數分別為12份和15份，陽性率分別為40%和50%。兩種檢測方法對牛病毒性腹瀉的檢測結果較為相近，但還是略有差異。
4 討論
牛病毒性腹瀉病毒屬於黃病毒科，瘟病毒屬成員，是無節段的單一的RNA病毒。因此，如果要開展分子方面檢測，也就是RT-PCR檢測，在操作過程中需要對基因組RNA進行操作，這就要求整個實驗過程中不能混入RNA酶，對檢測環境的要求較為嚴格，導致不能對農村散戶進行推廣。而牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測(血清) 試劑盒也需要操作者具備相關的專業技能，除此之外，還需要專業的移液槍和吸頭，以及昂貴的酶標儀等儀器，這使基層的養殖戶不能直接使用，某種程度會延誤對疫病的早期診斷，從而錯過對牛病毒性腹瀉的最佳治療時機，最終導致不必要的經濟損失，使牛病毒性腹瀉病毒的進一步蔓延，不利於對該傳染病的防控與凈化。
雖然，免疫膠體金試紙檢測卡使用上特別方便，但截止目前，在牛病毒性腹瀉的檢測試劑盒中未見有免疫膠體金試紙檢測卡的報道，為給基層農村養牛戶尋找一種行之有效，並且方便操作的檢測手段。本研究根據豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒同屬黃病毒科，瘟病毒屬成員，並且兩者在血清學上存在交叉反應，基於此考慮，我們嘗試用豬瘟病毒快速檢測試紙卡檢測疑似感染牛病毒性腹瀉病毒血清，結果顯示，豬瘟病毒快速檢測試紙卡完全可以用於牛病毒性腹瀉的檢測，只是檢測結果與牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測(血清) 試劑盒略有差異。至於哪種方法更準確，這需要進行RT-PCR等分子生物學方法來驗證。
牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）屬於黃病毒科，瘟病毒屬成員，主要引起牛病毒性腹瀉-黏膜病，造成患牛免疫耐受、持續性感染、母牛流產、死胎和畸形胎。20世紀40年代，在加拿大首次發現該論文聯盟http://wWW.LWlm.CoM病，之後向其他國產蔓延，目前該病呈世界性分布，給養牛業健康發展帶來了巨大障礙。為控制牛病毒性腹瀉病毒的傳播與蔓延，早期診斷是關鍵，本研究採用豬瘟膠體金快速檢測試紙卡檢測牛病毒性腹瀉抗體水平。
1 材料
30份疑似感染牛病毒性腹瀉病毒患牛的抗凝血。豬瘟病毒快速檢測試紙卡（貨號：M371328）購自克格儀器有限公司；牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測(血清) 試劑盒（貨號：99-43810）購自北京祥龍環宇生物技術有限公司。
2 方法
2.1 應用豬瘟膠體金快速檢測試紙卡檢測牛病毒性腹瀉抗體(血清)
2.1.1 操作步驟 從30份患牛抗凝血中分離血清，將分離的血清加入到豬瘟膠體金快速檢測試紙卡的檢測孔內，50ul/孔，放置於室溫中15min後，觀察反應結果。
2.1.2 判定方法 豬瘟膠體金快速檢測試紙卡T區（檢測線）呈現紫紅色，並且C區（對照線）也呈現紫紅色時，判定為陽性。當T區不變色，而C區呈現紫紅色，則判定為陰性。如果C區不呈現紫紅色時，此卡不能使用，為失效檢測卡。
2.2 應用牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測試劑盒檢測抗體(血清)
2.2.1 操作步驟
2.2.1.1 編號 將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔，空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同。
2.2.1.2 加樣 分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然後在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl。加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2.2.1.3 孵育 用封板膜封板後置37℃孵育30min。
2.2.1.4 洗滌 小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s後棄去，如此重複5次，拍干。
2.2.1.5 加酶 每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。孵育同2.2.1.3，洗滌同2.2.1.4。
2.2.1.6 顯色 每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色15min。
2.2.1.7 終止 每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。
2.2.1.8 測定結果 以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液後15min以內進行。
2.2.2 判定方法
2.2.2.1 試驗有效性 陽性對照孔平均值≥1.00；陰性對照平均值≤0.10。
2.2.2.2 臨界值(CUT OFF)計算 臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。
2.2.2.3 陰性判定 樣品OD值< 臨界值(CUT OFF)者為牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)陰性。
2.2.2.4 陽性判定 樣品OD值≥ 臨界值(CUT OFF)者為牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)陽性。
3 結果
用豬瘟膠體金快速檢測試紙卡和牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測試劑盒檢測30份患牛血清，牛病毒性腹瀉陽性數分別為12份和15份，陽性率分別為40%和50%。兩種檢測方法對牛病毒性腹瀉的檢測結果較為相近，但還是略有差異。
4 討論
牛病毒性腹瀉病毒屬於黃病毒科，瘟病毒屬成員，是無節段的單一的RNA病毒。因此，如果要開展分子方面檢測，也就是RT-PCR檢測，在操作過程中需要對基因組RNA進行操作，這就要求整個實驗過程中不能混入RNA酶，對檢測環境的要求較為嚴格，導致不能對農村散戶進行推廣。而牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測(血清) 試劑盒也需要操作者具備相關的專業技能，除此之外，還需要專業的移液槍和吸頭，以及昂貴的酶標儀等儀器，這使基層的養殖戶不能直接使用，某種程度會延誤對疫病的早期診斷，從而錯過對牛病毒性腹瀉的最佳治療時機，最終導致不必要的經濟損失，使牛病毒性腹瀉病毒的進一步蔓延，不利於對該傳染病的防控與凈化。
雖然，免疫膠體金試紙檢測卡使用上特別方便，但截止目前，在牛病毒性腹瀉的檢測試劑盒中未見有免疫膠體金試紙檢測卡的報道，為給基層農村養牛戶尋找一種行之有效，並且方便操作的檢測手段。本研究根據豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒同屬黃病毒科，瘟病毒屬成員，並且兩者在血清學上存在交叉反應，基於此考慮，我們嘗試用豬瘟病毒快速檢測試紙卡檢測疑似感染牛病毒性腹瀉病毒血清，結果顯示，豬瘟病毒快速檢測試紙卡完全可以用於牛病毒性腹瀉的檢測，只是檢測結果與牛病毒性腹瀉抗原ELISA檢測(血清) 試劑盒略有差異。至於哪種方法更準確，這需要進行RT-PCR等分子生物學方法來驗證。
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