作者：邱艷，檀英霞，李立立，李素波，呂秋霜，查，章揚培
【摘要】
本 研究 採用異硫氰酸螢光素標記鼠、獼猴、豬和人的修飾與未修飾自體和異體紅細胞(RBC)並給小鼠和獼猴實施輸注，觀察回輸體內RBC 24小時存活率的變化和差異。結果發現：未修飾小鼠RBC在小鼠體內24小時存活率為74%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾的小鼠RBC在小鼠體內24小時存活率為45%，兩者間有顯著差異；未修飾人RBC在小鼠體內24小時存活率為8%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾人RBC在小鼠體內24小時存活率為5%，兩者間無顯著差異。修飾的獼猴RBC自體回輸後24小時的存活率大於90%，而修飾的人RBC和豬RBC在給獼猴回輸後2小時其存活率已降至零。結論：RBC標記 方法 及不同種實驗小鼠的選擇對小鼠實驗結果 影響 不大，但mPEG種類和濃度對鼠RBC壽命的有一定程度影響。用鼠RBC做自體回輸來評價mPEG修飾人RBC的中mPEG是否影響人紅細胞的壽命是不可靠的，修飾人RBC回輸給小鼠可以作為評價修飾人RBC壽命和安全性的動物模型。大哺乳動物異種RBC輸注很難觀察到修飾RBC的存活率和壽命長短。適合評價修飾人RBC壽命和安全性的大動物模型有待於進一步探索。
【關鍵詞】mPEG-SPA； 紅細胞；輸血； 動物模型
Abstract This study was aimed to investigate the survival rate and difference of transfused modified and ummodified RBC at 24 hours. The modified and unmodified RBC from mice，monkey，pig and human were labeled by using FITC，then these blood RBCs were transfused to homogeneous and heterogeneous animals. The result showed that 24 hour survival rate of unmodified mice RBC transfused to mice was 74%，while survival rate of 2.0 mmol/L mPEG-SPA modified mice RBC transfused to mice was 45%，difference between them was significant. The 24 hour survived rate of unmodified human RBC transfused to mice was 8%，while 24 hours survival rate of 2.0 mmol/L mPEG-SPA modified human RBC transfused to mice was 5% without statistical difference. The 24 hour survived rate of homogeneous transfusion of modified monkey RBC was 90%，while survival rate of modified human and pig RBC was zero on 24 hours after transfusion to monkey. It is concluded that RBC labeling methods and mice species are unrelated to 24 hours survival rate，but mPEG variety and concentration are related to mouse RBC life-span. It is incredible to use mouse RBC homogeneous transfusion result instead of human RBC to evaluate longevity and safety of modified human RBC. But modified human RBC transfused to mice can be a model to evaluate longevity of modified human RBC. It is very difficult to get the result about modified RBC life span by RBC transfusion among great heterogeneous mammal animals. So evaluation in large mammal animal models needs to be further studied.
Key words mPEG-SPA ; red blood cell; transfusion blood; animal model
mPEG-SPA修飾的RBC輸入體內的安全性及壽命是通用RBC研究的主要 內容 之一，通用RBC在未來臨床的 應用 有著重要的意義。體內24小時存活率是評價RBC結構和功能是否正常的一個重要指標，為此我們採用小鼠和獼猴為實驗模型，用異硫氰酸螢光素標記［1］鼠、獼猴、豬和人的修飾與未修飾的RBC，實施動物自體和異體輸注，並檢測回輸體內RBC 24小時的螢光強度，來判斷修飾與未修飾的RBC在小鼠和獼猴體內的存活情況，確定mPEG-SPA修飾對RBC壽命和對受者安全性的影響及探索建立評價和觀察mPEG-SPA修飾的RBC在異種動物體內壽命和體內存活率的動物模型。
材料和方法
動物及RBC
實驗動物昆明鼠由軍事醫學 科學 院實驗動物中心提供，6-8周齡，雄性，共18隻，其中12隻為受血小鼠，6隻為供血小鼠；獼猴由北京動物園提供，健康，雄性，共3隻，其中1號猴重9.5 kg，2號猴重11 kg，3號猴重10.5 kg；AB型RhD(+)人的RBC由北京市紅十字血液中心提供，豬的RBC由北京SPF中心提供。
試劑
華鑫生物工程公司的FITC; NECTAR的20 kD mPEG-SPA，北京BDST MAP血液保養液。
儀器
FACS Calibur(Becton Dickinson產品) 流式細胞儀，Beckman 5 diff血球計數儀。
小鼠實驗
昆明鼠眼窩取血2 ml，加入280 μl CPDA血液保養液，2 500×g離心1分鐘，用生理鹽水洗滌3次，用2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾，PBS（pH 7.2）懸浮細胞至45%；對照組小鼠RBC經洗滌後不修飾直接同樣懸浮後，均與142 μg/ml FITC按1∶1混合，37℃水浴20分鐘，標記對照組及修飾組小鼠，按上述步驟同樣處理CPDA保存的人RBC。將每3隻小鼠分為1組，共4組：分別為輸未修飾小鼠的RBC的對照組（1），輸2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾的小鼠RBC的實驗組（1），輸未修飾的人RBC的對照組（2），輸2.0 mmol/L mPEG-SPA修飾的人RBC 實驗組（2）。通過尾靜脈給每隻小鼠輸入0.5 ml懸浮RBC。輸小鼠RBC的小鼠分別於注射後15、45、80分鐘及2、3、4、20和24小時時剪尾取血，輸人RBC的小鼠分別於注射後5、20、40、60分鐘及2、3、4、18和24小時時剪尾取血，加入1％多聚甲醛固定。流式細胞儀測定百分數。把5分鐘和15分鐘後取血測定的螢光標記的RBC的百分數設為100％，之後將測定的百分數與之相比，繪製螢光標記RBC百分比曲線， 計算 24小時存活率，並與未修飾的RBC相比較。
獼猴實驗
未修飾的人RBC與猴血漿的交叉配血
按10 mg/kg的劑量用吹管給猴子注射鹽酸氯胺酮，將其麻醉，取獼猴血用冷吸收放散實驗鑑定3隻獼猴的類ABO血型，用熱吸收放散法檢測獼猴Rh血型，將未修飾的人RhD(+)ABRBC與3隻獼猴血漿用抗人球方法進行交叉配血，同時做輸血前血生化、血常規以及尿生化檢查。
修飾的人RBC與猴血清的交叉配血
稱取1.68g mPEG-SPA，加入36.7ml PBS（pH 8.0），配成 2.0 mmol/L mPEG-SPA，加入5 ml人RBC，25℃搖床搖晃60分鐘修飾人RBC並加入MAP液保存。修飾後RBC與猴血清用抗人球方法進行交叉配血。
未修飾的豬RBC與猴血漿的交叉配血
取未修飾的豬血5-6 ml與3隻獼猴血漿用抗人球方法進行交叉配血。
未修飾和修飾的豬RBC與猴血清的交叉配血
取豬RBC 5-6 ml 用PBS（pH 5.6）洗滌2次，按50 U/ml加入半乳糖苷酶進行酶解，酶解後用PBS（pH 8.0）洗滌1次，然後用生理鹽水洗滌3次，與猴血清相配進行交叉配血。用1.0 mmol/L mPEG-SPA包裹酶解後豬RBC，再次與猴血清相配進行交叉配血，根據配血相容結果確定輸注修飾的人和豬RBC的實驗猴和對照猴。
輸注血液的標記 按0.425 μg/ml稱取FITC，並用PBS（pH 7.4）配成50 ml溶液，攪拌子攪拌過夜，充分溶解的FITC用濾器過濾，與修飾的人RBC、修飾的豬RBC以及對照猴自身RBC按11(v∶v)加入FITC溶液。37℃搖床反應30分鐘，取出後用PBS（pH 74）洗滌2次，生理鹽水洗滌1次，然後用生理鹽水配成RBC懸液，用於輸血。
收藏