劉 麗a，曾長立b
（江漢大學，a.醫學院；b.生命科學學院/湖北省豆類（蔬菜）工程技術研究中心，武漢 ４３００５６）
摘要：設計不同濃度的ＣａＣｌ２溶液，在對菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）鹽脅迫前採用根部澆灌和葉部噴施的方法進行誘導，鈣誘導５ ｄ後，對菠菜幼苗再進行１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液處理，測定其形態建成和生理生化指標。結果表明，外源鈣能顯著提高鹽脅迫下菠菜的形態建成指標；顯著增加可溶性蛋白質和葉綠素含量；顯著提高ＳＯＤ和ＰＯＤ活性；顯著降低丙二醛（ＭＤＡ）和游離脯氨酸含量。當外源鈣離子濃度為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，其降低鹽脅迫傷害效應的效果較好。
關鍵詞 ：菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）；鹽脅迫；外源鈣；化學誘抗劑；生理效應
中圖分類號：Ｓ６３６．１文獻標識碼：A文章編號：0439－８114（２０15）01－0118-04
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０31
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｉｏｎｓ ｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｓｐｉｎａｃｈ ｕｎｄｅｒ ＮａＣｌ Ｓｔｒｅｓｓ
ＬＩＵ Ｌｉa，ＺＥＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｌｉb
（a.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；b．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊｉａｎｇｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，／Ｈｕｂｅｉ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｌｅｇｕｍｅ Ｐｌａｎｔｓ，
Ｗｕｈａｎ ４３００５６， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｓｐｉｎａｃｈ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．） ｗｉｔｈ ｒｏｏｔ ｐｏｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｌｅａｆ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂｅｆｏｒｅ ＮａＣｌ ｓｔｒｅｓｓ． Ａｆｔｅｒ ５ ｄａｙｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃtion ｗｉｔｈ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ， １５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ｓｔｒｅｓｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｐｉｎａｃｈ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ. Mｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｅｘｅｓ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ obviously ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ. Tｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ， ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ＳＯＤ ａｎｄ ＰＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ were improved， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＤＡ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ was ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ reduced． It was indicated ｔｈａｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣａＣｌ２ ｗａｓ ３０ ｍｍｏｌ／Ｌ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｓａｌｔ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｐｉｎａｃｈ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）；ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ； ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ； ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｌｉｃｉｔｏｒ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔ
收稿日期：２０１４－０９－０１
基金項目：國家科技支撐計劃項目（２０１４ＢＡＤ１４Ｂ０５）；武漢市科技攻關計劃項目（２０１２５０４９９１４５－１４）；湖北省豆類（蔬菜）工程技術研究中心開放
性基金項目（２０１４07）
作者簡介：劉 麗（１９７３－），女，四川資陽人，講師，主要從事生物化學方面的研究，（電話）１３８７１１７５６７６（電子信箱）３０２６３７４６１＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，
曾長立（１９７２－），湖南新化人，教授，博士，碩士生導師，主要從事植物營養生理、環保型資源高效農業模式方面的研究，（電話）１５８２７３１６９６８（電子信箱）ｚｅｎｇｃｈａｎｇｌｉ６１１１＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。
隨著鹽鹼地面積的不斷增加和土壤鹽漬化程度的日益加劇，農作物的生產受到極大影響，土壤鹽漬化成為制約農業生產的重要因素［１］。另外，隨著工業污染的加劇、海水的盲目開發利用、化肥的大量投入以及設施生產的迅猛發展，導致了土壤次生鹽漬化加重［２］，土壤鹽漬化已成為設施栽培中普遍存在的問題。對北京、濟南、上海、江蘇等地大棚土壤調查發現，大棚土壤普遍存在著不同程度的次生鹽漬化現象，己嚴重影響了蔬菜作物的生長發育［３］。鹽脅迫對植物的影響機理可綜合為阻礙植物的生長發育［４］、造成滲透脅迫［５］、離子失衡［６］、活性氧傷害［７］、營養虧缺［８］和抑制光合作用［９］等。目前，針對鹽害可採取２種措施來進行改良，一是改良土壤；二是進行農作物耐鹽育種和栽培，提高農作物的耐鹽性。而利用生物措施來治理鹽害被普遍認為是最經濟有效的方法［１０］。化學誘抗劑一般是指能夠誘導植物產生抗逆反應的化學物質，也稱為抗逆誘導子或抗逆激發子，具有無毒、無害、無污染的特點，因而採用化學誘抗劑提高作物耐鹽性是與發展可持續農業相適應的一項重要綠色生產技術。Ｃａ２＋作為植物必需的一種礦質營養元素，在保護植物細胞膜結構和功能的完整性、穩定細胞壁結構、調節離子運輸和選擇性、控制離子交換行為和細胞壁中酶活性中扮演了關鍵角色［１１］。近年來，研究發現Ｃａ２＋參與鹽脅迫等多種逆境脅迫過程，施加鈣一方面可以緩解因Ｃａ２＋不足而引起的礦質營養脅迫，另一方面可以增強質膜的穩定性和鈣信號系統的正常功能，阻止細胞內Ｋ＋的外流和Ｎａ＋的大量進入，以維持細胞內離子平衡，從而提高植物的抗鹽性［１２］。
菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．） 是一種重要的葉菜類蔬菜，營養豐富［１３］， 在世界範圍內均有較大栽培面積。菠菜為中等耐鹽作物，但是在鹽鹼地栽培及次生鹽漬化比較嚴重的大棚栽培生產中，鹽脅迫嚴重影響了其產量與品質。有關外源鈣離子作為化學誘抗劑能否提高鹽脅迫下菠菜耐鹽性、其運用效果如何等方面的研究還未見報道。因此，本研究設計了６個不同濃度Ｃａ２＋進行誘導，研究了外源鈣離子誘導後對鹽脅迫下菠菜幼苗的形態建成、生理生化指標的影響，探討了其降低菠菜幼苗鹽害效應的生理生化機制，為充分利用鹽鹼地種植蔬菜，減輕設施園藝生產中土壤次生鹽漬化問題，培養健壯幼苗並提高其耐鹽性等方面提供依據。
１ 材料與方法
１．１ 種苗培養
以日本春秋大葉菠菜為試驗材料，將菠菜種子播於塑料營養缽中，採用基質草炭∶蛭石＝２∶１（體積比），每立方米加入腐熟膨化雞糞５ ｋｇ、三元素復合肥１．５ ｋｇ，用５０％多菌靈１００ ｇ／ｍ３消毒。待幼苗長到有６片真葉時，移入裝有相同基質的塑料盆。
１．２ 材料處理
菠菜移栽１０ ｄ後，進行根際初始誘導，誘抗劑ＣａＣｌ２的濃度分別設為０、１０、２０、３０、４０、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，共６個處理，每個處理３次重複。用根灌法在幼苗根部澆入不同濃度的ＣａＣｌ２，每株２０ ｍＬ；初始誘導２ ｄ後葉面噴施進行強化誘導，用手持小噴霧器，均勻噴洒幼苗葉部，以量足但不滴為準。強化誘導３ ｄ後施加鹽脅迫，用根灌法把１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液緩慢注入根際基質中，每盆４０ ｍＬ，早晚各脅迫１次。
１．３ 指標測定與數據分析
鹽脅迫後第５天取樣進行菠菜形態建成指標和生理生化指標的測定。測定幼苗株高（子葉節到生長點之間的距離）、莖粗（莖基部）、展開葉片數、全株鮮重及全株乾重，記錄數據最後計算出壯苗指數。
壯苗指數＝莖粗／株高×全株乾重
葉綠素含量的測定採用ＳＰＡＤ法測定；丙二醛（ＭＤＡ）含量測定採用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性測定採用ＮＢＴ光化還原法；過氧化物酶（ＰＯＤ）採用愈創木酚比色法測定；可溶性蛋白質含量的測定採用考馬斯亮藍法；游離脯氨酸活性的測定採用茚三酮法。試驗數據採用ＤＰＳ統計軟體進行方差分析，並對平均數採用ＬＳＤ法進行多重比較。
２ 結果與分析
２．１ 外源Ｃａ２＋對ＮａＣｌ脅迫下菠菜形態建成指標的影響
由表１可知，不同濃度的Ｃａ２＋誘導對鹽脅迫下菠菜生長發育的影響存在顯著差異。其中，３０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋誘導下菠菜長勢最好，未用Ｃａ２＋誘導的菠菜長勢最差。其中株高、展開葉片、乾重和壯苗指數中，３０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋處理與其他各濃度處理相比差異均達到顯著水平。表明施用Ｃａ２＋濃度為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，能顯著促進鹽脅迫下菠菜的生長發育和提高壯苗指數，有效緩解和減輕菠菜的鹽害效應，而較高濃度的Ｃａ２＋則顯著降低了壯苗指數，反而對菠菜幼苗的形態建成不利。
２．２ 外源Ｃａ２＋對ＮａＣｌ脅迫下菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質含量的影響
鹽脅迫下，外源鈣離子對菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質含量的影響存在差異（圖１）。對於葉綠素含量而言，與對照相比低濃度的外源Ｃａ２＋對葉綠素含量影響不顯著，但是當其濃度增加到３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，則可以顯著提高菠菜葉片葉綠素含量；而進一步提高外源Ｃａ２＋濃度其作用效果呈明顯下降的趨勢。由此可見，當遭受鹽脅迫時，外施濃度為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋可使菠菜葉片葉綠素正常合成，從而緩解葉片鹽脅迫下光合作用的降低。對於可溶性蛋白質含量來說，低濃度Ｃａ２＋誘導後，幼苗葉片中可溶性蛋白質含量與對照相比差異未達到顯著水平（圖１），表明外施低濃度的外源鈣離子沒有達到其效果；而較高濃度的Ｃａ２＋誘導後，其含量反而比低濃度處理的顯著降低。當外源鈣離子為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，可以顯著增加菠菜葉片可溶性蛋白質的含量。
２．３ 外源Ｃａ２＋對鹽脅迫下菠菜葉片中ＭＤＡ和游離脯氨酸含量的影響
與對照相比，使用外源Ｃａ２＋誘導後可顯著降低鹽脅迫下菠菜葉片中ＭＤＡ的累積（圖２）。但不同濃度的Ｃａ２＋誘導處理之間差異不顯著，說明不同Ｃａ２＋濃度的誘導均能有效降低菠菜葉片中的ＭＤＡ含量。對於游離脯氨酸而言，１０～２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的外源Ｃａ２＋誘導下其處理之間差異未達到顯著水平，但是當外源Ｃａ２＋誘導濃度提高到３０ ｍｍｏｌ／Ｌ－１時，則可顯著增加菠菜葉片中游離脯氨酸的含量；而進一步增加Ｃａ２＋誘導濃度，其作用效果則明顯下降（圖２）。
２．４ 外源Ｃａ２＋對鹽脅迫下菠菜葉片中ＳＯＤ和ＰＯＤ活性的影響
外源Ｃａ２＋對鹽脅迫下菠菜葉片中ＳＯＤ和ＰＯＤ活性的影響見圖３。從圖３可知，隨著外源Ｃａ２＋誘導濃度的增加，菠菜葉片中ＳＯＤ和ＰＯＤ活性呈先升高後降低的趨勢。使用一定濃度範圍內的外源Ｃａ２＋誘導可顯著增加ＳＯＤ和ＰＯＤ活性。對於ＳＯＤ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋誘導濃度與對照相比能顯著提高菠菜葉片ＳＯＤ活性， 但與２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋誘導濃度處理間差異不顯著。而２０～４０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋誘導濃度處理間差異也未達到顯著水平。當Ｃａ２＋濃度增加到５０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，反而使ＳＯＤ活性顯著降低。當Ｃａ２＋濃度為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，菠菜葉片ＰＯＤ活性達到最高值，與其他處理間差異顯著。
３ 討論
鹽脅迫是影響作物生長和降低作物產量的主要障礙因子之一。從形態建成指標來看，鹽分對非鹽生植物的脅迫效應就是阻止其生長［１４］。在本試驗中，ＮａＣｌ脅迫使菠菜的生長受到嚴重抑制，而通過使用外源Ｃａ２＋進行誘導後可顯著緩解這種抑制作用，且能顯著增加乾物質的積累和提高壯苗指數，增強植株的耐鹽性。但過高濃度的Ｃａ２＋進行誘導後其作用效果反而顯著下降，可能是ＣａＣｌ２也作為一種鹽分，增加了土壤根際中的Ｃｌ－，抑制根系對ＮＯ３ˉ等陰離子養分的吸收［１５］。
研究表明，各種細胞器中受鹽分影響比較敏感的是葉綠素［１６］。鹽脅迫條件下，ＮａＣｌ能增強葉綠素酶的活性， 加速葉綠素分解。本研究中，使用３０ ｍｍｏｌ／Ｌ以上外源Ｃａ２＋後可顯著提高菠菜葉綠素含量，這與在蕓薹屬植物上的研究結果一致［１７］。ＣａＣｌ２能提高葉綠素含量，其可能的機理是ＣａＣｌ２能提高抗氧化酶活性，清除活性氧，有效延緩葉綠素含量的下降，增強菠菜對鹽脅迫的適應，提高葉片捕捉和利用光能的能力。此外，外源鈣能提高菠菜葉片中的可溶性蛋白質含量，這與劉雪琴等［１８］在玉米上的研究結果一致。
鹽脅迫下ＭＤＡ含量的增加可能是活性氧（ＲＯＳ）所導致的氧化脅迫對細胞膜結構的破壞［１９］，而外源Ｃａ２＋減少或阻止鹽脅迫下Ｎａ＋對Ｃａ２＋的替換，從而提高了膜的流動性、減少了活性氧的產生［２０］以及抑制了膜脂的過氧化，以維持細胞膜正常的結構，保證植物體各種代謝循環的正常進行。另外，游離脯氨酸作為一種重要的滲透調節物質，在逆境條件下大量累積［２１］，待逆境解除後主要用來參與葉綠素的合成，隨著逆境的緩解很快減少。本研究中採用外源Ｃａ２＋進行誘導後，可以顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，與陳淑芳等［２２］在黃瓜上的結論一致。脯氨酸的積累一方面可以增加細胞的滲透調節能力，另一方面又可以避免細胞氨中毒。鹽脅迫下外源Ｃａ２＋能顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，是否是因為其參與了脯氨酸積累的信號轉導作用還值得深入研究。
對於ＰＯＤ來說，其影響趨勢與ＳＯＤ相似，但是Ｃａ２＋誘導濃度為４０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，ＰＯＤ活性就明顯降低。植物在遭受逆境脅迫時會引起氧化脅迫的產生［２３］，導致生成活性氧（ＲＯＳ）而破壞植物組織及細胞。植物體內的抗氧化系統，如ＳＯＤ、ＰＯＤ等可有效減少這些活性氧的破壞作用。而採用外源Ｃａ２＋能顯著提高鹽脅迫下菠菜幼苗葉片中的ＳＯＤ與ＰＯＤ活性，這與其他研究結果一致［２４］。因此，外源Ｃａ２＋通過提高菠菜幼苗葉片中這些保護酶的活性，增強了清除活性氧的能力，從而減少其對膜結構和功能的破壞。
４ 小結
採用外源Ｃａ２＋誘導後可顯著促進鹽脅迫下菠菜的生長，減輕鹽害，增加植株乾重及鮮重，顯著增加壯苗指數，顯著提高葉綠素、可溶性蛋白質與游離脯氨酸含量，提高細胞保護酶ＳＯＤ和ＰＯＤ活性，顯著降低菠菜葉片中ＭＤＡ含量，減輕鹽脅迫對葉片膜脂過氧化的程度。其中，３０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＣａＣｌ２誘導處理在提高菠菜抗鹽性上效果較好。
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（責任編輯 趙 娟）
（江漢大學，a.醫學院；b.生命科學學院/湖北省豆類（蔬菜）工程技術研究中心，武漢 ４３００５６）
摘要：設計不同濃度的ＣａＣｌ２溶液，在對菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）鹽脅迫前採用根部澆灌和葉部噴施的方法進行誘導，鈣誘導５ ｄ後，對菠菜幼苗再進行１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液處理，測定其形態建成和生理生化指標。結果表明，外源鈣能顯著提高鹽脅迫下菠菜的形態建成指標；顯著增加可溶性蛋白質和葉綠素含量；顯著提高ＳＯＤ和ＰＯＤ活性；顯著降低丙二醛（ＭＤＡ）和游離脯氨酸含量。當外源鈣離子濃度為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，其降低鹽脅迫傷害效應的效果較好。
關鍵詞 ：菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）；鹽脅迫；外源鈣；化學誘抗劑；生理效應
中圖分類號：Ｓ６３６．１文獻標識碼：A文章編號：0439－８114（２０15）01－0118-04
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０31
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｉｏｎｓ ｏｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｓｐｉｎａｃｈ ｕｎｄｅｒ ＮａＣｌ Ｓｔｒｅｓｓ
ＬＩＵ Ｌｉa，ＺＥＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｌｉb
（a.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；b．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊｉａｎｇｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，／Ｈｕｂｅｉ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｌｅｇｕｍｅ Ｐｌａｎｔｓ，
Ｗｕｈａｎ ４３００５６， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｓｐｉｎａｃｈ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．） ｗｉｔｈ ｒｏｏｔ ｐｏｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｌｅａｆ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂｅｆｏｒｅ ＮａＣｌ ｓｔｒｅｓｓ． Ａｆｔｅｒ ５ ｄａｙｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃtion ｗｉｔｈ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ， １５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ｓｔｒｅｓｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｐｉｎａｃｈ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ. Mｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｅｘｅｓ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ obviously ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ. Tｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ， ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ＳＯＤ ａｎｄ ＰＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ were improved， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＤＡ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ was ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ reduced． It was indicated ｔｈａｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣａＣｌ２ ｗａｓ ３０ ｍｍｏｌ／Ｌ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ ｓａｌｔ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｐｉｎａｃｈ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）；ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ； ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ； ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｌｉｃｉｔｏｒ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔ
收稿日期：２０１４－０９－０１
基金項目：國家科技支撐計劃項目（２０１４ＢＡＤ１４Ｂ０５）；武漢市科技攻關計劃項目（２０１２５０４９９１４５－１４）；湖北省豆類（蔬菜）工程技術研究中心開放
性基金項目（２０１４07）
作者簡介：劉 麗（１９７３－），女，四川資陽人，講師，主要從事生物化學方面的研究，（電話）１３８７１１７５６７６（電子信箱）３０２６３７４６１＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，
曾長立（１９７２－），湖南新化人，教授，博士，碩士生導師，主要從事植物營養生理、環保型資源高效農業模式方面的研究，（電話）１５８２７３１６９６８（電子信箱）ｚｅｎｇｃｈａｎｇｌｉ６１１１＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。
隨著鹽鹼地面積的不斷增加和土壤鹽漬化程度的日益加劇，農作物的生產受到極大影響，土壤鹽漬化成為制約農業生產的重要因素［１］。另外，隨著工業污染的加劇、海水的盲目開發利用、化肥的大量投入以及設施生產的迅猛發展，導致了土壤次生鹽漬化加重［２］，土壤鹽漬化已成為設施栽培中普遍存在的問題。對北京、濟南、上海、江蘇等地大棚土壤調查發現，大棚土壤普遍存在著不同程度的次生鹽漬化現象，己嚴重影響了蔬菜作物的生長發育［３］。鹽脅迫對植物的影響機理可綜合為阻礙植物的生長發育［４］、造成滲透脅迫［５］、離子失衡［６］、活性氧傷害［７］、營養虧缺［８］和抑制光合作用［９］等。目前，針對鹽害可採取２種措施來進行改良，一是改良土壤；二是進行農作物耐鹽育種和栽培，提高農作物的耐鹽性。而利用生物措施來治理鹽害被普遍認為是最經濟有效的方法［１０］。化學誘抗劑一般是指能夠誘導植物產生抗逆反應的化學物質，也稱為抗逆誘導子或抗逆激發子，具有無毒、無害、無污染的特點，因而採用化學誘抗劑提高作物耐鹽性是與發展可持續農業相適應的一項重要綠色生產技術。Ｃａ２＋作為植物必需的一種礦質營養元素，在保護植物細胞膜結構和功能的完整性、穩定細胞壁結構、調節離子運輸和選擇性、控制離子交換行為和細胞壁中酶活性中扮演了關鍵角色［１１］。近年來，研究發現Ｃａ２＋參與鹽脅迫等多種逆境脅迫過程，施加鈣一方面可以緩解因Ｃａ２＋不足而引起的礦質營養脅迫，另一方面可以增強質膜的穩定性和鈣信號系統的正常功能，阻止細胞內Ｋ＋的外流和Ｎａ＋的大量進入，以維持細胞內離子平衡，從而提高植物的抗鹽性［１２］。
菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．） 是一種重要的葉菜類蔬菜，營養豐富［１３］， 在世界範圍內均有較大栽培面積。菠菜為中等耐鹽作物，但是在鹽鹼地栽培及次生鹽漬化比較嚴重的大棚栽培生產中，鹽脅迫嚴重影響了其產量與品質。有關外源鈣離子作為化學誘抗劑能否提高鹽脅迫下菠菜耐鹽性、其運用效果如何等方面的研究還未見報道。因此，本研究設計了６個不同濃度Ｃａ２＋進行誘導，研究了外源鈣離子誘導後對鹽脅迫下菠菜幼苗的形態建成、生理生化指標的影響，探討了其降低菠菜幼苗鹽害效應的生理生化機制，為充分利用鹽鹼地種植蔬菜，減輕設施園藝生產中土壤次生鹽漬化問題，培養健壯幼苗並提高其耐鹽性等方面提供依據。
１ 材料與方法
１．１ 種苗培養
以日本春秋大葉菠菜為試驗材料，將菠菜種子播於塑料營養缽中，採用基質草炭∶蛭石＝２∶１（體積比），每立方米加入腐熟膨化雞糞５ ｋｇ、三元素復合肥１．５ ｋｇ，用５０％多菌靈１００ ｇ／ｍ３消毒。待幼苗長到有６片真葉時，移入裝有相同基質的塑料盆。
１．２ 材料處理
菠菜移栽１０ ｄ後，進行根際初始誘導，誘抗劑ＣａＣｌ２的濃度分別設為０、１０、２０、３０、４０、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，共６個處理，每個處理３次重複。用根灌法在幼苗根部澆入不同濃度的ＣａＣｌ２，每株２０ ｍＬ；初始誘導２ ｄ後葉面噴施進行強化誘導，用手持小噴霧器，均勻噴洒幼苗葉部，以量足但不滴為準。強化誘導３ ｄ後施加鹽脅迫，用根灌法把１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液緩慢注入根際基質中，每盆４０ ｍＬ，早晚各脅迫１次。
１．３ 指標測定與數據分析
鹽脅迫後第５天取樣進行菠菜形態建成指標和生理生化指標的測定。測定幼苗株高（子葉節到生長點之間的距離）、莖粗（莖基部）、展開葉片數、全株鮮重及全株乾重，記錄數據最後計算出壯苗指數。
壯苗指數＝莖粗／株高×全株乾重
葉綠素含量的測定採用ＳＰＡＤ法測定；丙二醛（ＭＤＡ）含量測定採用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性測定採用ＮＢＴ光化還原法；過氧化物酶（ＰＯＤ）採用愈創木酚比色法測定；可溶性蛋白質含量的測定採用考馬斯亮藍法；游離脯氨酸活性的測定採用茚三酮法。試驗數據採用ＤＰＳ統計軟體進行方差分析，並對平均數採用ＬＳＤ法進行多重比較。
２ 結果與分析
２．１ 外源Ｃａ２＋對ＮａＣｌ脅迫下菠菜形態建成指標的影響
由表１可知，不同濃度的Ｃａ２＋誘導對鹽脅迫下菠菜生長發育的影響存在顯著差異。其中，３０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋誘導下菠菜長勢最好，未用Ｃａ２＋誘導的菠菜長勢最差。其中株高、展開葉片、乾重和壯苗指數中，３０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋處理與其他各濃度處理相比差異均達到顯著水平。表明施用Ｃａ２＋濃度為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，能顯著促進鹽脅迫下菠菜的生長發育和提高壯苗指數，有效緩解和減輕菠菜的鹽害效應，而較高濃度的Ｃａ２＋則顯著降低了壯苗指數，反而對菠菜幼苗的形態建成不利。
２．２ 外源Ｃａ２＋對ＮａＣｌ脅迫下菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質含量的影響
鹽脅迫下，外源鈣離子對菠菜葉片中葉綠素和可溶性蛋白質含量的影響存在差異（圖１）。對於葉綠素含量而言，與對照相比低濃度的外源Ｃａ２＋對葉綠素含量影響不顯著，但是當其濃度增加到３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，則可以顯著提高菠菜葉片葉綠素含量；而進一步提高外源Ｃａ２＋濃度其作用效果呈明顯下降的趨勢。由此可見，當遭受鹽脅迫時，外施濃度為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋可使菠菜葉片葉綠素正常合成，從而緩解葉片鹽脅迫下光合作用的降低。對於可溶性蛋白質含量來說，低濃度Ｃａ２＋誘導後，幼苗葉片中可溶性蛋白質含量與對照相比差異未達到顯著水平（圖１），表明外施低濃度的外源鈣離子沒有達到其效果；而較高濃度的Ｃａ２＋誘導後，其含量反而比低濃度處理的顯著降低。當外源鈣離子為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，可以顯著增加菠菜葉片可溶性蛋白質的含量。
２．３ 外源Ｃａ２＋對鹽脅迫下菠菜葉片中ＭＤＡ和游離脯氨酸含量的影響
與對照相比，使用外源Ｃａ２＋誘導後可顯著降低鹽脅迫下菠菜葉片中ＭＤＡ的累積（圖２）。但不同濃度的Ｃａ２＋誘導處理之間差異不顯著，說明不同Ｃａ２＋濃度的誘導均能有效降低菠菜葉片中的ＭＤＡ含量。對於游離脯氨酸而言，１０～２０ ｍｍｏｌ／Ｌ的外源Ｃａ２＋誘導下其處理之間差異未達到顯著水平，但是當外源Ｃａ２＋誘導濃度提高到３０ ｍｍｏｌ／Ｌ－１時，則可顯著增加菠菜葉片中游離脯氨酸的含量；而進一步增加Ｃａ２＋誘導濃度，其作用效果則明顯下降（圖２）。
２．４ 外源Ｃａ２＋對鹽脅迫下菠菜葉片中ＳＯＤ和ＰＯＤ活性的影響
外源Ｃａ２＋對鹽脅迫下菠菜葉片中ＳＯＤ和ＰＯＤ活性的影響見圖３。從圖３可知，隨著外源Ｃａ２＋誘導濃度的增加，菠菜葉片中ＳＯＤ和ＰＯＤ活性呈先升高後降低的趨勢。使用一定濃度範圍內的外源Ｃａ２＋誘導可顯著增加ＳＯＤ和ＰＯＤ活性。對於ＳＯＤ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｃａ２＋誘導濃度與對照相比能顯著提高菠菜葉片ＳＯＤ活性， 但與２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋誘導濃度處理間差異不顯著。而２０～４０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２＋誘導濃度處理間差異也未達到顯著水平。當Ｃａ２＋濃度增加到５０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，反而使ＳＯＤ活性顯著降低。當Ｃａ２＋濃度為３０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，菠菜葉片ＰＯＤ活性達到最高值，與其他處理間差異顯著。
３ 討論
鹽脅迫是影響作物生長和降低作物產量的主要障礙因子之一。從形態建成指標來看，鹽分對非鹽生植物的脅迫效應就是阻止其生長［１４］。在本試驗中，ＮａＣｌ脅迫使菠菜的生長受到嚴重抑制，而通過使用外源Ｃａ２＋進行誘導後可顯著緩解這種抑制作用，且能顯著增加乾物質的積累和提高壯苗指數，增強植株的耐鹽性。但過高濃度的Ｃａ２＋進行誘導後其作用效果反而顯著下降，可能是ＣａＣｌ２也作為一種鹽分，增加了土壤根際中的Ｃｌ－，抑制根系對ＮＯ３ˉ等陰離子養分的吸收［１５］。
研究表明，各種細胞器中受鹽分影響比較敏感的是葉綠素［１６］。鹽脅迫條件下，ＮａＣｌ能增強葉綠素酶的活性， 加速葉綠素分解。本研究中，使用３０ ｍｍｏｌ／Ｌ以上外源Ｃａ２＋後可顯著提高菠菜葉綠素含量，這與在蕓薹屬植物上的研究結果一致［１７］。ＣａＣｌ２能提高葉綠素含量，其可能的機理是ＣａＣｌ２能提高抗氧化酶活性，清除活性氧，有效延緩葉綠素含量的下降，增強菠菜對鹽脅迫的適應，提高葉片捕捉和利用光能的能力。此外，外源鈣能提高菠菜葉片中的可溶性蛋白質含量，這與劉雪琴等［１８］在玉米上的研究結果一致。
鹽脅迫下ＭＤＡ含量的增加可能是活性氧（ＲＯＳ）所導致的氧化脅迫對細胞膜結構的破壞［１９］，而外源Ｃａ２＋減少或阻止鹽脅迫下Ｎａ＋對Ｃａ２＋的替換，從而提高了膜的流動性、減少了活性氧的產生［２０］以及抑制了膜脂的過氧化，以維持細胞膜正常的結構，保證植物體各種代謝循環的正常進行。另外，游離脯氨酸作為一種重要的滲透調節物質，在逆境條件下大量累積［２１］，待逆境解除後主要用來參與葉綠素的合成，隨著逆境的緩解很快減少。本研究中採用外源Ｃａ２＋進行誘導後，可以顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，與陳淑芳等［２２］在黃瓜上的結論一致。脯氨酸的積累一方面可以增加細胞的滲透調節能力，另一方面又可以避免細胞氨中毒。鹽脅迫下外源Ｃａ２＋能顯著提高菠菜幼苗葉片中游離脯氨酸的含量，是否是因為其參與了脯氨酸積累的信號轉導作用還值得深入研究。
對於ＰＯＤ來說，其影響趨勢與ＳＯＤ相似，但是Ｃａ２＋誘導濃度為４０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，ＰＯＤ活性就明顯降低。植物在遭受逆境脅迫時會引起氧化脅迫的產生［２３］，導致生成活性氧（ＲＯＳ）而破壞植物組織及細胞。植物體內的抗氧化系統，如ＳＯＤ、ＰＯＤ等可有效減少這些活性氧的破壞作用。而採用外源Ｃａ２＋能顯著提高鹽脅迫下菠菜幼苗葉片中的ＳＯＤ與ＰＯＤ活性，這與其他研究結果一致［２４］。因此，外源Ｃａ２＋通過提高菠菜幼苗葉片中這些保護酶的活性，增強了清除活性氧的能力，從而減少其對膜結構和功能的破壞。
４ 小結
採用外源Ｃａ２＋誘導後可顯著促進鹽脅迫下菠菜的生長，減輕鹽害，增加植株乾重及鮮重，顯著增加壯苗指數，顯著提高葉綠素、可溶性蛋白質與游離脯氨酸含量，提高細胞保護酶ＳＯＤ和ＰＯＤ活性，顯著降低菠菜葉片中ＭＤＡ含量，減輕鹽脅迫對葉片膜脂過氧化的程度。其中，３０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＣａＣｌ２誘導處理在提高菠菜抗鹽性上效果較好。
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（責任編輯 趙 娟）
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