前 言
胰腺是人體最重要的消化器官之一，兼有內外分泌功能。由於胰腺位置較為隱匿，位於腹膜後，其病變在臨床上往往很容易被忽視。隨著診療技術的不斷進步，對胰腺病變的檢出率也有所升高。常見的胰腺疾病包括胰腺癌、急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）、慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）、胰腺導管內乳頭狀粘液瘤等，其中，CP和胰腺癌最為重要。
CP 被定義為是一種胰腺組織進行性炎症性疾病，其病理特徵主要為胰腺纖維化和腺泡萎縮，嚴重時可導致胰腺內外分泌功能障礙，病變多為不可逆性且具有惡變風險[1-3]。CP 病因非常複雜，可與飲酒、膽道疾病、基因突變、自身免疫紊亂等多種發病因素有關，現行比較公認的是 CPTIGAR-O 病因分類（見表一）[4]；而病因的複雜性也在一定程度上決定了其發病機制的複雜性，這也成為目前胰腺病學的研究熱點所在。到現在為止，儘管對 CP 發病機制的研究較多，但是其確切的分子發病發病機制仍不明確。因此，探索 CP 相關信號轉導通路，進而找到新的治療靶點，這對於提高我國整體 CP 診治水平、改善患者生活質量具有極其重要的現實意義。
臨床上患者最常見的症狀有有反覆 AP 發作、單純持續性或間歇性腹痛、糖尿病、脂肪瀉、消化不良、體重減輕等。部分患者確診時可無任何症狀，僅在查體時檢出胰腺鈣化。根據《慢性胰腺炎診治指南（2012，上海）》，CP 的具體診斷標準主要包括：（1）患者具有典型的臨床表現（如反覆發作性上腹疼痛或 AP 發作、腹瀉等）；（2）經影像學檢查（如胰腺薄層 CT、MRCP 等）明確有胰腺鈣化、胰管結石、胰管狹窄或擴張等改變，部分患者可合併胰腺萎縮；（3）如患者接受胰腺組織活檢，病理組織學評估有特徵性改變（如間質纖維化、腺泡萎縮等）；（4）患者臨床上確診符合胰腺外分泌功能不全的臨床表現和相關功能試驗結果（如脂肪瀉、消化不良等）。如患者符合（2）或（3）標準，則該患者可確診 CP；如僅具備（1）和（4）標準，則只能初步擬診 CP，而不能確診，但可按照 CP 進行試驗性治療，待評估治療效果和隨訪影像學檢查再做出診斷。另外，該指南還提出，根據患者的主要臨床表現，同時結合實驗室化驗和影像學檢查，將 CP 主要分為四種臨床分型（見表二）[5-6]，以便於臨床醫生對病情的評估和治療策略的選擇。在 CP 的治療方面，目前仍無有效的治癒方法，治療原則是緩解症狀、防止復發和併發症的發生。對於確診 CP 的患者，推薦內科保守治療，主要採取的方法是內鏡介入和藥物，前者主要是胰管清理、取石，保持胰管通常；後者主要是補充胰酶、緩解腹痛。部分患者在上述治療無效或可疑惡變時可選擇接受手術治療[7-9]。
特發性 CP（idiopathic CP, ICP）是指現有診斷技術下，無明確病因的一種類型，占 CP 比例可達 10-25%，在青少年患者的比例則更高[10]。近些年來，分子生物學和影像學診斷技術的優化有助於明確特發性 CP 的發病因素。在很多確診為 ICP 患者中，發現其與基因突變、自身免疫紊亂、胰腺分裂等因素有關。由於這部分患者無明確的致病性環境因素，因此，也更適合作為研究 CP 遺傳易感性的研究對象，成為進一步探索 CP 遺傳學發病基礎的突破點，進而為後續研究 CP 遺傳學發病背景奠定基礎。遺傳性 CP 是另一種特殊類型的 CP，其具有明確的陽性遺傳家族史。該疾病是常染色體不完全顯性遺傳，外顯受環境因素影響。最常見的突變是陽離子胰蛋白酶原（cationic trypsinogen gene, PRSS1）基因。PRSS1 基因功能獲得性突變可引起胰蛋白酶在胰腺內提前激活並伴有活性升高，進而引發胰腺自身被胰酶消化，從而導致 CP的發生。遺傳性 CP 患者發病年齡較其他類型 CP 患者要早，出現內外分泌功能障礙的比例要高，且進展為胰腺癌的風險也高。
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第一部分青少年特發性慢性胰腺炎遺傳易感性研究
ICP 是 CP 的一種重要類型，其被定義為無明確發病原因和危險因素 CP。有文獻報道，約 10-25%CP 患者被診斷為 ICP。而在西方國家，青少年 ICP 患者比例可高達40-60%，在我國，這個比例則更高，可達 73.8%[11]。ICP 在臨床表現和診療原則上無異於其他類型；但是由於其無明確的病因，因此很難找到有效的針對性治療和預防策略。ICP 患者與其他 CP 患者一樣，病情容易反覆發作，病程較長，部分患者可終生髮作。ICP 的發病機制目前仍不明確，尤其是青少年 ICP，研究的則更少。為此，我們考慮到青少年 ICP 患者的發病年齡比較早，其接受到外界環境因素如吸煙、酒精、代謝毒物等的影響的可能性則較小，與之相對，在他們的發病過程中，內在遺傳因素的作用則相對突出，這也決定了青少年 ICP 患者更加適合作為探索 CP 遺傳易感性研究的對象。
近 20 年來，對於遺傳因素在 CP 發病過程中的作用逐漸被廣泛認可。既往有研究相繼報道了 PRSS1 基因、囊性纖維化跨膜轉導調節因子基因（cystic fibrosistransmembrane conductance regulator，CFTR) (OMIM 602421)，分泌性胰蛋白酶抑制劑或 Kazal 1 型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(serine protease inhibitor Kazal type1, PSTI orSPINK1) (OMIM 167790)和糜蛋白酶 C 基因（chymotrypsin C, CTRC) (OMIM 601405)與 CP 的發生有關[12-16]。2012 年，Whitcomb DC 等通過大規模全基因組關聯分析（genome-wide association study, GWAS）首次發現了與散發性酒精性 CP 相關的新的易感基因 CLDN2[17]；該基因編碼的是 claudin-2 蛋白，是一種緊密連接蛋白，它在內皮細胞之間可以形成陽離子選擇性通道和水通道。正常情況下，CLDN2 在胰腺導管細胞之間、胰島細胞之間呈低表達狀態，但是在胰腺腺泡細胞受到外界刺激後也可以表達。此外，還有研究報道 CP 也與拷貝數變異（copy number variations, CNVs）密切相關。然而，我國尚無 ICP 遺傳學發病機制的相關報道，並且目前的研究熱點也多集中在 CP 疾病本身上，而沒有把青少年 ICP 作為一個單獨的研究隊列來進行分析。另外，考慮到與西方國家相比，我國具有不同的人口和文化特徵、社會經濟、氣候以及生活習慣，上述差異也提示我國 CP 具有不同於西方國家的遺傳學背景。另外，深入探索 CP 遺傳學發病機制對於優化疾病診治模式具有十分重要的意義[18-19]。為此，我們首次對 75 例青少年 ICP 患者進行了易感基因的檢測，並對其臨床特徵進行關聯分析。旨在通過本項研究，找到研究我國 CP 易感基因譜的契機，為今後深入探索CP 發病機制初步奠定基礎。
一、資料與方法
（一）研究對象
自 1997 年 1 月至 2008 年 12 月期間，就診於第二軍醫大學第一附屬醫院消化內科且被確診為 CP、首次發病年齡不滿 18 周歲的患者均可入選本研究。如患者有飲酒、吸煙、陽性家族史，或檢出有膽道疾病、高鈣血症等則被排除此項研究。通過檢索電子病歷系統，獲取患者列表和相關臨床資料，並對患者進行初步篩選；最終共納入75 例 ICP 青少年患者。CP 診斷標準為典型的腹痛、腹瀉、糖尿病等病史和至少有如下表現之一：①明確的胰腺間質纖維化、腺泡萎縮的病理學證據；②影像學證實有胰管結石或鈣化、胰腺假性囊腫等特徵；③ERCP 顯示胰管改變，包括胰管狹窄、擴張、不規則、粗細不均、串珠狀等，以及胰管結石或鈣化[20]。ICP 診斷標準為已確診 CP，但經詢問病史和常規檢驗及腹部超聲、CT 等影像學檢查仍無法明確病因者。
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二、結果
（一）一般資料和臨床特徵
共75例青少年ICP患者納入此項研究，其中男性40例，女性35例，男女性別比接近1：1。首次發病年齡為11.9歲（範圍為3-18歲）。
81.3%（61/75）患者以AP發作為首發症狀，有13例（17.3%）患者為腹痛首發，3例（4.0%）患者為體重減輕首發，1例（1.3%）患者為腹瀉首發，1例（1.3%）患者為高血糖首發。
影像學檢查結果顯示45例（60.0%）患者有胰管結石。57例（76.0%）患者有胰管形態改變（如狹窄或/和擴張等），15例（20.0%）患者有胰腺鈣化，15例（20.0%）患者有胰腺假性囊腫，4例（5.3%）患者有胰腺分裂（見表1-4）。
入院時實驗室檢查發現6例（8.0%）患者有CA19-9水平升高；6例（8.0%）患者有輕度血脂升高；2例（2.7%）患者有血糖升高，但未達到糖尿病的診斷標準；2例（2.7%）患者有血鈣下降。
（二）PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和CLDN2基因突變檢測
對 75 例患者進行了 PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和 CLDN2 基因共五個基因的檢測。非同義突變包括錯義突變、缺失等。PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和CLDN2 基因的非同義突變陽性率分別為 9.3%（7/75），57.3%（43/75），0.0%（0/75），0.0%（0/75）和 1.3%（1/75）（見表 1-5）。
在本項研究中，無一例患者攜帶 2 種以上的非同義突變。PRSS1 和 SPINK1 基因總突變率為 66.6%。此外，1 例患者攜帶 c.319 -326 del 新生突變，該突變位於 CFTR基因的第四外顯子，為 GCTTCCTA 共 8 個鹼基的缺失（見圖 1-1），首次入院影像學特徵見圖 1-2。為明確該基因是先天遺傳還是後天突變獲得，我們還對其父母進行了基因檢測（圖 1-3），結果顯示其父母並不攜帶該突變，故此突變為新生突變（de novomutation）。這也初步解釋了臨床上大多數患兒父母並非 CP 患者的現象，啟發了後續對青少年 ICP 的 de novo 突變研究的開展。
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第三部分 散發性慢性胰腺炎易感基因 CPA1 突變及其與臨床特徵相關分析............45
一、資料與方法.............................................................46
二、結果....................................................................50
三、討論...............................................................54
四、結論...............................................................56
第四部分 青少年特發性慢性胰腺炎相關 de novo 突變篩選及鑑定.....58
一、資料與方法.......................................................59
二、結果................................................................63
三、討論..................................................................67
第三部分散發性慢性胰腺炎易感基因 CPA1 突變及其與臨床特徵相關分析
近些年來，對 CP 的研究熱度逐漸上升，這主要與其發病率呈上升趨勢、以及仍無有效根治措施，患者需要反覆就診等原因有關。CP 已經成為臨床上最常見的胰腺疾病之一。CP 比較公認的定義是一種慢性進行性胰腺炎症性疾病，病程較長，可遷延不愈，終生髮病，且症狀容易反覆發作，從而影響到患者的生活質量[69-70]。目前，臨床上推薦的治療方法主要包括藥物、內鏡介入和手術治療，但上述方法都不能達到有效治癒 CP 的目的，因此，現階段的對 CP 的治療策略基本停留在“治標”的階段。如前所述，CP 的發病機制非常複雜，多個信號傳導通路和調控基因參與其發病過程，這在為今後實現 CP 的靶向治療提供了潛在治療靶點的同時，也為如何找到有效的治療靶點帶來了很大的難度。綜上所述，研究 CP 的具體分子發病機制有助於找到新的治療方法、開發新的藥物，從而提高 CP 整體診治水平。既往研究報道已證實 CP 具有明確的遺傳學發病基礎，這也是當前疾病研究的大勢所趨。前期我們已經對青少年ICP 和遺傳性 CP 患者分別進行了臨床特徵以及致病基因突變的分析，結果顯示我國CP 患者可能具有與西方國家不同的遺傳學發病背景[71-73]。這也高度提示有必要以我國散發性 CP 患者為研究對象，來探索具有中國特點的 CP 相關易感基因譜。與此同時，這也將彌補中國 CP 患者突變數據缺乏的不足、豐富全球 CP 遺傳學研究的突變資料庫。
在 2013 年，Witt H 等分別對歐洲、印度和日本散發性非酒精性 CP 患者進行了CPA1 基因突變的檢測，並且提出 CPA1 基因突變與早髮型 CP 有關[66]，該結論發表在《Nature Genetics》。首先，以 944 例德國非酒精性 CP 患者和 3938 例健康對照者為測序對象，篩選 CPA1 基因突變，並通過關聯分析找到可能的致病突變；分別有 29例（3.1%）CP 患者和 5 例（0.1%）健康對照者攜帶功能缺損性突變（OR 為 24.9，P=1.5x10-16）；9.7%年輕患者（≤10 歲）攜帶上述突變（OR 為 84.0，P=4.1x10-24）。然後，在 600 例患者和 2432 例健康對照者組成的歐洲研究隊列，230 例患者和 264 例健康對照的印度研究隊列，以及 247 例患者和 341 例健康對照者的日本研究隊列中進行了驗證，結果顯示 CPA1 缺陷型突變與 CP 發病呈正相關（P<0.05）。儘管 CP 的流行病學和發病機制具有一定的地區差異，但有研究者推測 CPA1 基因突變在 CP 發病過程中的作用可能是全球性的[74]。因此，對我國 CP 患者進行 CPA1 基因檢測，可擴展基因突變資料庫，豐富 CPA1 基因突變發病機制的研究。目前，尚無新的研究對CPA1 基因突變進行報道。
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第四部分青少年特發性慢性胰腺炎相關 de novo 突變篩選及鑑定
前期研究結果顯示青少年 ICP 患者中已知突變的攜帶率並不高，因此，這高度提示可能存在其他致病突變[83-84]。同時，在臨床實踐中，往往觀察到大多數青少年 ICP患者的父母都是正常非慢性胰腺炎健康人，這種現象引起了我們的關注。通過查閱大量文獻，發現與青少年 ICP 相似，散發性精神分裂症和自閉症患者的父母也都是正常人，而且這兩種疾病的患者也多為青少年發病。新近研究報道精神分裂症和自閉症與de novo 單核苷酸變異（single-nucleotide variants，SNVs）或 de novo 拷貝數突變有關，並且指出這種突變並不是偶然發生的，其突變的發生頻率與多種體內外因素有關，其相關結果已發表在《Natre Genetics》、《Nature》上[85-87]。考慮到人類很多疾病具有相互重疊的遺傳學發病基礎，再加上青少年 ICP 也具備與上述兩種疾病相似的臨床病程特徵，如發病年齡小、多為散發性發生等；另外，在對 75 例青少年 ICP 患者進行已知易感基因檢測的前期研究中，我們已經發現有一例患兒出現CFTR基因上的de novo突變，且其父母並不攜帶該突變[71]。綜上，我們認為可以參考精神分裂症和自閉症的研究思維和研究方法對青少年 ICP 有關的 de novo 突變進行探索研究，提出如下假設：青少年 ICP 發病可能與父母生殖細胞分裂時受到某種刺激後誘發 de novo 突變有關，這些新生突變引起一系列後續基因表達水平和/或功能異常，從而導致正常表型的父母生出 ICP 患兒。
因此，本研究在前期工作的基礎上，進一步調查和收集青少年 ICP 患者及其父母的臨床資料，並留取血標本，提取血 DNA。首先利用一代測序剔除 PRSS1 和 SPINK1突變陽性的家庭；對 PRSS1 和 SPINK1 突變陰性家庭成員的血 DNA 進行全基因組外顯子捕獲，然後應用二代測序平台進行高通量測序；最後結合測序數據，採用多學科研究方法對每個入選青少年 ICP 家庭中的三個人進行外顯子定位和比對，檢出 denovo 突變，然後在發現的 de novo 突變中篩選致病突變，確定和驗證致病突變所在基因為致病基因，並對該基因的功能進行深入探索。另外，我們還可以進一步通過上調或沉默該致病基因的表達，來評估上述研究確定的致病基因所表達產物在 CP 發病過程中的地位。總之，發現並確定與青少年 ICP 發病有關的 de novo 突變將為找到可以安全有效治療青少年 ICP 的新方法提供良好的研究思路，同時為全面研究 CP 遺傳學發病基礎奠定堅實的基礎。
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參考文獻（略）
胰腺是人體最重要的消化器官之一，兼有內外分泌功能。由於胰腺位置較為隱匿，位於腹膜後，其病變在臨床上往往很容易被忽視。隨著診療技術的不斷進步，對胰腺病變的檢出率也有所升高。常見的胰腺疾病包括胰腺癌、急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）、慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）、胰腺導管內乳頭狀粘液瘤等，其中，CP和胰腺癌最為重要。
CP 被定義為是一種胰腺組織進行性炎症性疾病，其病理特徵主要為胰腺纖維化和腺泡萎縮，嚴重時可導致胰腺內外分泌功能障礙，病變多為不可逆性且具有惡變風險[1-3]。CP 病因非常複雜，可與飲酒、膽道疾病、基因突變、自身免疫紊亂等多種發病因素有關，現行比較公認的是 CPTIGAR-O 病因分類（見表一）[4]；而病因的複雜性也在一定程度上決定了其發病機制的複雜性，這也成為目前胰腺病學的研究熱點所在。到現在為止，儘管對 CP 發病機制的研究較多，但是其確切的分子發病發病機制仍不明確。因此，探索 CP 相關信號轉導通路，進而找到新的治療靶點，這對於提高我國整體 CP 診治水平、改善患者生活質量具有極其重要的現實意義。
臨床上患者最常見的症狀有有反覆 AP 發作、單純持續性或間歇性腹痛、糖尿病、脂肪瀉、消化不良、體重減輕等。部分患者確診時可無任何症狀，僅在查體時檢出胰腺鈣化。根據《慢性胰腺炎診治指南（2012，上海）》，CP 的具體診斷標準主要包括：（1）患者具有典型的臨床表現（如反覆發作性上腹疼痛或 AP 發作、腹瀉等）；（2）經影像學檢查（如胰腺薄層 CT、MRCP 等）明確有胰腺鈣化、胰管結石、胰管狹窄或擴張等改變，部分患者可合併胰腺萎縮；（3）如患者接受胰腺組織活檢，病理組織學評估有特徵性改變（如間質纖維化、腺泡萎縮等）；（4）患者臨床上確診符合胰腺外分泌功能不全的臨床表現和相關功能試驗結果（如脂肪瀉、消化不良等）。如患者符合（2）或（3）標準，則該患者可確診 CP；如僅具備（1）和（4）標準，則只能初步擬診 CP，而不能確診，但可按照 CP 進行試驗性治療，待評估治療效果和隨訪影像學檢查再做出診斷。另外，該指南還提出，根據患者的主要臨床表現，同時結合實驗室化驗和影像學檢查，將 CP 主要分為四種臨床分型（見表二）[5-6]，以便於臨床醫生對病情的評估和治療策略的選擇。在 CP 的治療方面，目前仍無有效的治癒方法，治療原則是緩解症狀、防止復發和併發症的發生。對於確診 CP 的患者，推薦內科保守治療，主要採取的方法是內鏡介入和藥物，前者主要是胰管清理、取石，保持胰管通常；後者主要是補充胰酶、緩解腹痛。部分患者在上述治療無效或可疑惡變時可選擇接受手術治療[7-9]。
特發性 CP（idiopathic CP, ICP）是指現有診斷技術下，無明確病因的一種類型，占 CP 比例可達 10-25%，在青少年患者的比例則更高[10]。近些年來，分子生物學和影像學診斷技術的優化有助於明確特發性 CP 的發病因素。在很多確診為 ICP 患者中，發現其與基因突變、自身免疫紊亂、胰腺分裂等因素有關。由於這部分患者無明確的致病性環境因素，因此，也更適合作為研究 CP 遺傳易感性的研究對象，成為進一步探索 CP 遺傳學發病基礎的突破點，進而為後續研究 CP 遺傳學發病背景奠定基礎。遺傳性 CP 是另一種特殊類型的 CP，其具有明確的陽性遺傳家族史。該疾病是常染色體不完全顯性遺傳，外顯受環境因素影響。最常見的突變是陽離子胰蛋白酶原（cationic trypsinogen gene, PRSS1）基因。PRSS1 基因功能獲得性突變可引起胰蛋白酶在胰腺內提前激活並伴有活性升高，進而引發胰腺自身被胰酶消化，從而導致 CP的發生。遺傳性 CP 患者發病年齡較其他類型 CP 患者要早，出現內外分泌功能障礙的比例要高，且進展為胰腺癌的風險也高。
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第一部分青少年特發性慢性胰腺炎遺傳易感性研究
ICP 是 CP 的一種重要類型，其被定義為無明確發病原因和危險因素 CP。有文獻報道，約 10-25%CP 患者被診斷為 ICP。而在西方國家，青少年 ICP 患者比例可高達40-60%，在我國，這個比例則更高，可達 73.8%[11]。ICP 在臨床表現和診療原則上無異於其他類型；但是由於其無明確的病因，因此很難找到有效的針對性治療和預防策略。ICP 患者與其他 CP 患者一樣，病情容易反覆發作，病程較長，部分患者可終生髮作。ICP 的發病機制目前仍不明確，尤其是青少年 ICP，研究的則更少。為此，我們考慮到青少年 ICP 患者的發病年齡比較早，其接受到外界環境因素如吸煙、酒精、代謝毒物等的影響的可能性則較小，與之相對，在他們的發病過程中，內在遺傳因素的作用則相對突出，這也決定了青少年 ICP 患者更加適合作為探索 CP 遺傳易感性研究的對象。
近 20 年來，對於遺傳因素在 CP 發病過程中的作用逐漸被廣泛認可。既往有研究相繼報道了 PRSS1 基因、囊性纖維化跨膜轉導調節因子基因（cystic fibrosistransmembrane conductance regulator，CFTR) (OMIM 602421)，分泌性胰蛋白酶抑制劑或 Kazal 1 型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(serine protease inhibitor Kazal type1, PSTI orSPINK1) (OMIM 167790)和糜蛋白酶 C 基因（chymotrypsin C, CTRC) (OMIM 601405)與 CP 的發生有關[12-16]。2012 年，Whitcomb DC 等通過大規模全基因組關聯分析（genome-wide association study, GWAS）首次發現了與散發性酒精性 CP 相關的新的易感基因 CLDN2[17]；該基因編碼的是 claudin-2 蛋白，是一種緊密連接蛋白，它在內皮細胞之間可以形成陽離子選擇性通道和水通道。正常情況下，CLDN2 在胰腺導管細胞之間、胰島細胞之間呈低表達狀態，但是在胰腺腺泡細胞受到外界刺激後也可以表達。此外，還有研究報道 CP 也與拷貝數變異（copy number variations, CNVs）密切相關。然而，我國尚無 ICP 遺傳學發病機制的相關報道，並且目前的研究熱點也多集中在 CP 疾病本身上，而沒有把青少年 ICP 作為一個單獨的研究隊列來進行分析。另外，考慮到與西方國家相比，我國具有不同的人口和文化特徵、社會經濟、氣候以及生活習慣，上述差異也提示我國 CP 具有不同於西方國家的遺傳學背景。另外，深入探索 CP 遺傳學發病機制對於優化疾病診治模式具有十分重要的意義[18-19]。為此，我們首次對 75 例青少年 ICP 患者進行了易感基因的檢測，並對其臨床特徵進行關聯分析。旨在通過本項研究，找到研究我國 CP 易感基因譜的契機，為今後深入探索CP 發病機制初步奠定基礎。
一、資料與方法
（一）研究對象
自 1997 年 1 月至 2008 年 12 月期間，就診於第二軍醫大學第一附屬醫院消化內科且被確診為 CP、首次發病年齡不滿 18 周歲的患者均可入選本研究。如患者有飲酒、吸煙、陽性家族史，或檢出有膽道疾病、高鈣血症等則被排除此項研究。通過檢索電子病歷系統，獲取患者列表和相關臨床資料，並對患者進行初步篩選；最終共納入75 例 ICP 青少年患者。CP 診斷標準為典型的腹痛、腹瀉、糖尿病等病史和至少有如下表現之一：①明確的胰腺間質纖維化、腺泡萎縮的病理學證據；②影像學證實有胰管結石或鈣化、胰腺假性囊腫等特徵；③ERCP 顯示胰管改變，包括胰管狹窄、擴張、不規則、粗細不均、串珠狀等，以及胰管結石或鈣化[20]。ICP 診斷標準為已確診 CP，但經詢問病史和常規檢驗及腹部超聲、CT 等影像學檢查仍無法明確病因者。
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二、結果
（一）一般資料和臨床特徵
共75例青少年ICP患者納入此項研究，其中男性40例，女性35例，男女性別比接近1：1。首次發病年齡為11.9歲（範圍為3-18歲）。
81.3%（61/75）患者以AP發作為首發症狀，有13例（17.3%）患者為腹痛首發，3例（4.0%）患者為體重減輕首發，1例（1.3%）患者為腹瀉首發，1例（1.3%）患者為高血糖首發。
影像學檢查結果顯示45例（60.0%）患者有胰管結石。57例（76.0%）患者有胰管形態改變（如狹窄或/和擴張等），15例（20.0%）患者有胰腺鈣化，15例（20.0%）患者有胰腺假性囊腫，4例（5.3%）患者有胰腺分裂（見表1-4）。
入院時實驗室檢查發現6例（8.0%）患者有CA19-9水平升高；6例（8.0%）患者有輕度血脂升高；2例（2.7%）患者有血糖升高，但未達到糖尿病的診斷標準；2例（2.7%）患者有血鈣下降。
（二）PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和CLDN2基因突變檢測
對 75 例患者進行了 PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和 CLDN2 基因共五個基因的檢測。非同義突變包括錯義突變、缺失等。PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和CLDN2 基因的非同義突變陽性率分別為 9.3%（7/75），57.3%（43/75），0.0%（0/75），0.0%（0/75）和 1.3%（1/75）（見表 1-5）。
在本項研究中，無一例患者攜帶 2 種以上的非同義突變。PRSS1 和 SPINK1 基因總突變率為 66.6%。此外，1 例患者攜帶 c.319 -326 del 新生突變，該突變位於 CFTR基因的第四外顯子，為 GCTTCCTA 共 8 個鹼基的缺失（見圖 1-1），首次入院影像學特徵見圖 1-2。為明確該基因是先天遺傳還是後天突變獲得，我們還對其父母進行了基因檢測（圖 1-3），結果顯示其父母並不攜帶該突變，故此突變為新生突變（de novomutation）。這也初步解釋了臨床上大多數患兒父母並非 CP 患者的現象，啟發了後續對青少年 ICP 的 de novo 突變研究的開展。
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第三部分 散發性慢性胰腺炎易感基因 CPA1 突變及其與臨床特徵相關分析............45
一、資料與方法.............................................................46
二、結果....................................................................50
三、討論...............................................................54
四、結論...............................................................56
第四部分 青少年特發性慢性胰腺炎相關 de novo 突變篩選及鑑定.....58
一、資料與方法.......................................................59
二、結果................................................................63
三、討論..................................................................67
第三部分散發性慢性胰腺炎易感基因 CPA1 突變及其與臨床特徵相關分析
近些年來，對 CP 的研究熱度逐漸上升，這主要與其發病率呈上升趨勢、以及仍無有效根治措施，患者需要反覆就診等原因有關。CP 已經成為臨床上最常見的胰腺疾病之一。CP 比較公認的定義是一種慢性進行性胰腺炎症性疾病，病程較長，可遷延不愈，終生髮病，且症狀容易反覆發作，從而影響到患者的生活質量[69-70]。目前，臨床上推薦的治療方法主要包括藥物、內鏡介入和手術治療，但上述方法都不能達到有效治癒 CP 的目的，因此，現階段的對 CP 的治療策略基本停留在“治標”的階段。如前所述，CP 的發病機制非常複雜，多個信號傳導通路和調控基因參與其發病過程，這在為今後實現 CP 的靶向治療提供了潛在治療靶點的同時，也為如何找到有效的治療靶點帶來了很大的難度。綜上所述，研究 CP 的具體分子發病機制有助於找到新的治療方法、開發新的藥物，從而提高 CP 整體診治水平。既往研究報道已證實 CP 具有明確的遺傳學發病基礎，這也是當前疾病研究的大勢所趨。前期我們已經對青少年ICP 和遺傳性 CP 患者分別進行了臨床特徵以及致病基因突變的分析，結果顯示我國CP 患者可能具有與西方國家不同的遺傳學發病背景[71-73]。這也高度提示有必要以我國散發性 CP 患者為研究對象，來探索具有中國特點的 CP 相關易感基因譜。與此同時，這也將彌補中國 CP 患者突變數據缺乏的不足、豐富全球 CP 遺傳學研究的突變資料庫。
在 2013 年，Witt H 等分別對歐洲、印度和日本散發性非酒精性 CP 患者進行了CPA1 基因突變的檢測，並且提出 CPA1 基因突變與早髮型 CP 有關[66]，該結論發表在《Nature Genetics》。首先，以 944 例德國非酒精性 CP 患者和 3938 例健康對照者為測序對象，篩選 CPA1 基因突變，並通過關聯分析找到可能的致病突變；分別有 29例（3.1%）CP 患者和 5 例（0.1%）健康對照者攜帶功能缺損性突變（OR 為 24.9，P=1.5x10-16）；9.7%年輕患者（≤10 歲）攜帶上述突變（OR 為 84.0，P=4.1x10-24）。然後，在 600 例患者和 2432 例健康對照者組成的歐洲研究隊列，230 例患者和 264 例健康對照的印度研究隊列，以及 247 例患者和 341 例健康對照者的日本研究隊列中進行了驗證，結果顯示 CPA1 缺陷型突變與 CP 發病呈正相關（P<0.05）。儘管 CP 的流行病學和發病機制具有一定的地區差異，但有研究者推測 CPA1 基因突變在 CP 發病過程中的作用可能是全球性的[74]。因此，對我國 CP 患者進行 CPA1 基因檢測，可擴展基因突變資料庫，豐富 CPA1 基因突變發病機制的研究。目前，尚無新的研究對CPA1 基因突變進行報道。
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第四部分青少年特發性慢性胰腺炎相關 de novo 突變篩選及鑑定
前期研究結果顯示青少年 ICP 患者中已知突變的攜帶率並不高，因此，這高度提示可能存在其他致病突變[83-84]。同時，在臨床實踐中，往往觀察到大多數青少年 ICP患者的父母都是正常非慢性胰腺炎健康人，這種現象引起了我們的關注。通過查閱大量文獻，發現與青少年 ICP 相似，散發性精神分裂症和自閉症患者的父母也都是正常人，而且這兩種疾病的患者也多為青少年發病。新近研究報道精神分裂症和自閉症與de novo 單核苷酸變異（single-nucleotide variants，SNVs）或 de novo 拷貝數突變有關，並且指出這種突變並不是偶然發生的，其突變的發生頻率與多種體內外因素有關，其相關結果已發表在《Natre Genetics》、《Nature》上[85-87]。考慮到人類很多疾病具有相互重疊的遺傳學發病基礎，再加上青少年 ICP 也具備與上述兩種疾病相似的臨床病程特徵，如發病年齡小、多為散發性發生等；另外，在對 75 例青少年 ICP 患者進行已知易感基因檢測的前期研究中，我們已經發現有一例患兒出現CFTR基因上的de novo突變，且其父母並不攜帶該突變[71]。綜上，我們認為可以參考精神分裂症和自閉症的研究思維和研究方法對青少年 ICP 有關的 de novo 突變進行探索研究，提出如下假設：青少年 ICP 發病可能與父母生殖細胞分裂時受到某種刺激後誘發 de novo 突變有關，這些新生突變引起一系列後續基因表達水平和/或功能異常，從而導致正常表型的父母生出 ICP 患兒。
因此，本研究在前期工作的基礎上，進一步調查和收集青少年 ICP 患者及其父母的臨床資料，並留取血標本，提取血 DNA。首先利用一代測序剔除 PRSS1 和 SPINK1突變陽性的家庭；對 PRSS1 和 SPINK1 突變陰性家庭成員的血 DNA 進行全基因組外顯子捕獲，然後應用二代測序平台進行高通量測序；最後結合測序數據，採用多學科研究方法對每個入選青少年 ICP 家庭中的三個人進行外顯子定位和比對，檢出 denovo 突變，然後在發現的 de novo 突變中篩選致病突變，確定和驗證致病突變所在基因為致病基因，並對該基因的功能進行深入探索。另外，我們還可以進一步通過上調或沉默該致病基因的表達，來評估上述研究確定的致病基因所表達產物在 CP 發病過程中的地位。總之，發現並確定與青少年 ICP 發病有關的 de novo 突變將為找到可以安全有效治療青少年 ICP 的新方法提供良好的研究思路，同時為全面研究 CP 遺傳學發病基礎奠定堅實的基礎。
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參考文獻（略）