作者:唐麗娟,劉瑋煒 史大華 趙躍強 陶傳洲
【摘要】 黃酮類化合物是一類植物次生代謝產物,因其在醫藥、食品及化工方面有著重要的研究價值而得到了廣泛關注。各種用於研究黃酮類化合物的分離分析技術也在迅速 發展 ,薄層色譜技術仍以其快速、簡便、準確度高等優點而成為鑑別黃酮類化合物的首選方法。文章綜述了薄層層析技術在植物黃酮類化合物中的應用。
【關鍵詞】 黃酮類化合物; 薄層層析; 分離分析技術
Abstract∶Flavonoids which are a kind of secondary plant metabolites have been widely investigated for thEir potential of medicine, food and chemical engineering. And separation analysis technologies applied in flavonoids are developing rapidly. Thinlayer chromatography is firstly selected in identification of flavonoids for the rapid, simple and highly accurate advantages. Application of thinlayer chromatography in flavonoids of plants was reviewed in this paper.
Key words∶ Flavonoids; Thinlayer chromatography; Separation analysis technologies
黃酮類化合物屬植物多酚化合物,是植物次生代謝產物,該類化合物在醫藥、食品及化工方面有著重要的研究價值,已報道其有抗氧化性、抗炎抗菌、抑制血小板凝集及肥大細胞組胺釋放等作用,在癌症及心臟病等疾患上也顯示出 治療 潛力,因其在花色素中的存在而可能用來代替毒性合成顏料[1]。黃酮類化合物的來源主要有天然提取和人工合成兩種。其中天然提取的藥物因副作用小而引起了人們更大的研究興趣。隨著植物源化合物的研究,色譜技術日益成為天然產物中生物活性成分分離純化及分析的主要手段[2],薄層色譜(thinlayer chromatography,TLC)即薄層層析技術是發展較早的色譜方法之一,其基本原理是利用混合物各組分在某一物質中的吸附或者分配等性能的不同,使樣品溶液中各種物質進行反覆的吸附或者分配等作用,從而將各種組分分開。儘管諸如高效液相色譜、氣相色譜及色譜聯用等 現代 色譜技術的廣泛應用,薄層色譜技術以其快速、簡便、準確度高等優點仍是現代實驗室不可或缺的分析手段,在黃酮類化合物的研究中也被廣泛應用。本文綜述了薄層層析技術在植物黃酮類化合物中的應用進展。
1 TLC用於黃酮類化合物定性研究
用薄層層析進行黃酮類化合物的定性研究,目前採用的方法主要是與標準品或與 文獻 對照Rf值或將測試樣品圖譜與標準樣品圖譜相比較。標準品和樣品的Rf值、斑點形狀顏色及有無螢光等特徵都完全相同,則可作初步結論是同一化合物。但一般需結合化學反應或與紫外光譜等方法聯用加以確證。衛星星 [3] 在矽膠G薄層板上,以醋酸乙酯甲酸水(8∶3∶1)為展開劑、1% 三氯化鋁乙醇溶液顯色後於紫外燈下觀察,苦麥供試品與對照品蘆丁和槲皮素相應的位置上顯相同顏色的螢光斑點,而陰性對照色譜無相同斑點顯現。從層析結果可知苦麥籽殼提取物中主要含有蘆丁和槲皮素兩種黃酮類化合物。朱賁峰等[4]以薄層層析方法證明江西修水和福建永春的青錢柳的主要黃酮類成分基本相同,從而為對四氧嘧啶糖尿病小鼠具有顯著降血糖作用的青錢柳開發研究提供了有利的證據。該方法於矽膠G薄層板上,以醋酸乙酯甲酸水(8∶1∶1)為展開劑、1% 三氯化鋁乙醇溶液顯色時,於紫外燈(365 nm) 下檢視,兩種樣品均與對照品色譜相應的位置上,顯黃色的螢光斑點。黃紹軍等[5] 對由HPLC法純化的晶體以矽膠GF254,展開劑甲苯氯仿丙酮(40∶25∶35)進行TLC分析,其中一種結晶與槲皮素Rf值一致,Rf=0.50;另一種結晶與山萘酚Rf值一致,Rf=0.72;同時結合熔點、液相色譜、紅外光譜、核磁共振等分析方法進行結構表征,證實荔枝葉含有黃酮苷,其苷元為槲皮素和山萘酚。馮瑪莉等[6]以薄層層析方法建立了沙棘黃酮的質量控制方法,即在矽膠GF254薄層板上,以甲苯醋酸乙酯甲酸(5∶2∶1)為展開劑,檢出異鼠李素、槲皮素;異鼠李素、槲皮素的Rf值分別為0.60,0.49。該鑑別方法對應的樣品色譜斑點清晰,無拖尾、背景無干擾且重複性好。
雖然對於一個化合物來說,比移值Rf是一個特有的常數。但在文獻[5,6]中對照品均採用了由 中國 藥品生物製品檢定所提供的槲皮素,而在不同的色譜條件下槲皮素的Rf值分別是0.50和0.60,這就說明Rf值是受色譜條件即展開劑、吸附劑等因素影響的,因此用薄層層析進行定性分析樣品和標準品應在同一薄層板、同一條件下進行,點樣間隔時間不宜過長。層析條件的選擇對結果是至關重要的。
2 精製
天然提取樣品的純化可以通過重結晶、柱層析等方法得到,其中薄層層析也是常用的簡便方法。但操作中需注意的是薄層板面積要大,點樣量和矽膠量多的前提下才適合取樣和刮樣。 Zhao [7]研究組對采自新疆鷹嘴豆種子的矽膠柱層析得到的某些樣品組分用矽膠薄板層析進行純化後用以結構測試。劉玉紅等 [8]對由聚醯胺柱層析得到的黃酮活性組分進行矽膠GF254薄板(100 mm×200 mm)層析,吹乾後再加點數次,層析後刮下併合並Rf值相同的色帶,用乙醇溶解洗脫,得到各組分的溶液後以HPLC鑑定由薄層層析得到的樣品已經達到色譜純的要求,可以用於結構鑑定。
3 含量測定
薄層掃描法可以用於天然提取黃酮類化合物定量分析,該方法操作簡便,結果可靠。王亞娟等[9] 採用雙波長薄層色譜掃描法對蒲公英總黃酮的含量進行測定。於矽膠G薄層板上,以醋酸乙酯甲酸水(8∶1∶1)為展開劑展開後,測定波長λs=278 nm,參比波長λR=356 nm,測得蒲公英總黃酮含量為4.236%。
4 活性成分篩選
生物自顯影技術是將薄層色譜分離和生物活性測定相結合的藥物篩選方法, 是一種快速測定生物活性的手段[10]。何璐[11] 採用甲苯氯仿丙酮(5∶5∶7)的展開劑於矽膠板分離甘草黃酮,並用生物自顯影技術進行抗菌活性測定出了甘草黃酮中有抑菌活性成分,該方法操作簡單、耗費低、靈敏度高。
5 薄層層析條件選擇
用於黃酮類化合物薄層層析常用吸附劑是矽膠、聚醯胺。矽膠是一種極性吸附劑,一般用於弱極性的游離黃酮(黃酮苷);聚醯胺為氫鍵吸附,吸附能力與酚羥基多少、位置及氫鍵締合力大小有關,鑑別黃酮類化合物適用範圍廣。葛明菊[12] 利用聚醯胺薄層層析分析大血藤黃酮類化合物組成,藥用部位嫩莖含有Rf值為0.88的斑點而在其他部位無此斑點,分析該斑點可能為藥用成分。盧端萍等[13] 在矽膠G薄層板上以乙酸乙酯甲酸水(67∶13∶20)展開結果表明葫蘆茶中含蘆丁成分。黃酮苷類化合物極性強於游離黃酮,如與文獻[13]相比,王懷沖[14]在矽膠G薄層板上鑑別貫葉連翹中黃酮苷類(金絲桃苷)的存在,以極性大的展開劑醋酸乙酯丁酮甲醇水(5∶3∶1∶1)展開得到了很好的分離效果。對於既有較強極性的化合物,又有較弱極性成分的混合樣品中,可以採用二次或雙向展開。所以魚藤抽提液中的黃酮類化合物 [15]在矽膠H CMC薄板上用微量圓環技術快速而有效地找到了適合的展開劑,採用雙向展開得到了8個斑點,即以氯仿丙酮醋酸溶劑在豎直方向展開,再用甲苯氯仿丙酮溶劑在水平方向展開。含有多種極性成分的黃酮類化合物分離鑑別時可選用聚醯胺。劉嘉寶等 [16] 將聚醯胺薄層板以醋酸乙酯甲醇甲酸水(25∶1∶3∶23)為展開劑,紫外分析儀下檢視。供試液在以蘆丁、槲皮素、黃芩甙各標準液的相應位置出現相同的顏色斑點,它們的比移值Rf分別為0.46、0.20和0.16。因而可作定性分析的依據,說明雲南松花粉中主要含有黃酮類黃芩苷、黃酮醇類蘆丁及槲皮素3種成分。其他用於黃酮化合物薄層層析的吸附劑有纖維素、氰基矽膠等,纖維素用於分離極性強成分,氰基矽膠對於含不同極性成分或極性未知的黃酮化合物分離效果較佳[17]。
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【摘要】 黃酮類化合物是一類植物次生代謝產物,因其在醫藥、食品及化工方面有著重要的研究價值而得到了廣泛關注。各種用於研究黃酮類化合物的分離分析技術也在迅速 發展 ,薄層色譜技術仍以其快速、簡便、準確度高等優點而成為鑑別黃酮類化合物的首選方法。文章綜述了薄層層析技術在植物黃酮類化合物中的應用。
【關鍵詞】 黃酮類化合物; 薄層層析; 分離分析技術
Abstract∶Flavonoids which are a kind of secondary plant metabolites have been widely investigated for thEir potential of medicine, food and chemical engineering. And separation analysis technologies applied in flavonoids are developing rapidly. Thinlayer chromatography is firstly selected in identification of flavonoids for the rapid, simple and highly accurate advantages. Application of thinlayer chromatography in flavonoids of plants was reviewed in this paper.
Key words∶ Flavonoids; Thinlayer chromatography; Separation analysis technologies
黃酮類化合物屬植物多酚化合物,是植物次生代謝產物,該類化合物在醫藥、食品及化工方面有著重要的研究價值,已報道其有抗氧化性、抗炎抗菌、抑制血小板凝集及肥大細胞組胺釋放等作用,在癌症及心臟病等疾患上也顯示出 治療 潛力,因其在花色素中的存在而可能用來代替毒性合成顏料[1]。黃酮類化合物的來源主要有天然提取和人工合成兩種。其中天然提取的藥物因副作用小而引起了人們更大的研究興趣。隨著植物源化合物的研究,色譜技術日益成為天然產物中生物活性成分分離純化及分析的主要手段[2],薄層色譜(thinlayer chromatography,TLC)即薄層層析技術是發展較早的色譜方法之一,其基本原理是利用混合物各組分在某一物質中的吸附或者分配等性能的不同,使樣品溶液中各種物質進行反覆的吸附或者分配等作用,從而將各種組分分開。儘管諸如高效液相色譜、氣相色譜及色譜聯用等 現代 色譜技術的廣泛應用,薄層色譜技術以其快速、簡便、準確度高等優點仍是現代實驗室不可或缺的分析手段,在黃酮類化合物的研究中也被廣泛應用。本文綜述了薄層層析技術在植物黃酮類化合物中的應用進展。
1 TLC用於黃酮類化合物定性研究
用薄層層析進行黃酮類化合物的定性研究,目前採用的方法主要是與標準品或與 文獻 對照Rf值或將測試樣品圖譜與標準樣品圖譜相比較。標準品和樣品的Rf值、斑點形狀顏色及有無螢光等特徵都完全相同,則可作初步結論是同一化合物。但一般需結合化學反應或與紫外光譜等方法聯用加以確證。衛星星 [3] 在矽膠G薄層板上,以醋酸乙酯甲酸水(8∶3∶1)為展開劑、1% 三氯化鋁乙醇溶液顯色後於紫外燈下觀察,苦麥供試品與對照品蘆丁和槲皮素相應的位置上顯相同顏色的螢光斑點,而陰性對照色譜無相同斑點顯現。從層析結果可知苦麥籽殼提取物中主要含有蘆丁和槲皮素兩種黃酮類化合物。朱賁峰等[4]以薄層層析方法證明江西修水和福建永春的青錢柳的主要黃酮類成分基本相同,從而為對四氧嘧啶糖尿病小鼠具有顯著降血糖作用的青錢柳開發研究提供了有利的證據。該方法於矽膠G薄層板上,以醋酸乙酯甲酸水(8∶1∶1)為展開劑、1% 三氯化鋁乙醇溶液顯色時,於紫外燈(365 nm) 下檢視,兩種樣品均與對照品色譜相應的位置上,顯黃色的螢光斑點。黃紹軍等[5] 對由HPLC法純化的晶體以矽膠GF254,展開劑甲苯氯仿丙酮(40∶25∶35)進行TLC分析,其中一種結晶與槲皮素Rf值一致,Rf=0.50;另一種結晶與山萘酚Rf值一致,Rf=0.72;同時結合熔點、液相色譜、紅外光譜、核磁共振等分析方法進行結構表征,證實荔枝葉含有黃酮苷,其苷元為槲皮素和山萘酚。馮瑪莉等[6]以薄層層析方法建立了沙棘黃酮的質量控制方法,即在矽膠GF254薄層板上,以甲苯醋酸乙酯甲酸(5∶2∶1)為展開劑,檢出異鼠李素、槲皮素;異鼠李素、槲皮素的Rf值分別為0.60,0.49。該鑑別方法對應的樣品色譜斑點清晰,無拖尾、背景無干擾且重複性好。
雖然對於一個化合物來說,比移值Rf是一個特有的常數。但在文獻[5,6]中對照品均採用了由 中國 藥品生物製品檢定所提供的槲皮素,而在不同的色譜條件下槲皮素的Rf值分別是0.50和0.60,這就說明Rf值是受色譜條件即展開劑、吸附劑等因素影響的,因此用薄層層析進行定性分析樣品和標準品應在同一薄層板、同一條件下進行,點樣間隔時間不宜過長。層析條件的選擇對結果是至關重要的。
2 精製
天然提取樣品的純化可以通過重結晶、柱層析等方法得到,其中薄層層析也是常用的簡便方法。但操作中需注意的是薄層板面積要大,點樣量和矽膠量多的前提下才適合取樣和刮樣。 Zhao [7]研究組對采自新疆鷹嘴豆種子的矽膠柱層析得到的某些樣品組分用矽膠薄板層析進行純化後用以結構測試。劉玉紅等 [8]對由聚醯胺柱層析得到的黃酮活性組分進行矽膠GF254薄板(100 mm×200 mm)層析,吹乾後再加點數次,層析後刮下併合並Rf值相同的色帶,用乙醇溶解洗脫,得到各組分的溶液後以HPLC鑑定由薄層層析得到的樣品已經達到色譜純的要求,可以用於結構鑑定。
3 含量測定
薄層掃描法可以用於天然提取黃酮類化合物定量分析,該方法操作簡便,結果可靠。王亞娟等[9] 採用雙波長薄層色譜掃描法對蒲公英總黃酮的含量進行測定。於矽膠G薄層板上,以醋酸乙酯甲酸水(8∶1∶1)為展開劑展開後,測定波長λs=278 nm,參比波長λR=356 nm,測得蒲公英總黃酮含量為4.236%。
4 活性成分篩選
生物自顯影技術是將薄層色譜分離和生物活性測定相結合的藥物篩選方法, 是一種快速測定生物活性的手段[10]。何璐[11] 採用甲苯氯仿丙酮(5∶5∶7)的展開劑於矽膠板分離甘草黃酮,並用生物自顯影技術進行抗菌活性測定出了甘草黃酮中有抑菌活性成分,該方法操作簡單、耗費低、靈敏度高。
5 薄層層析條件選擇
用於黃酮類化合物薄層層析常用吸附劑是矽膠、聚醯胺。矽膠是一種極性吸附劑,一般用於弱極性的游離黃酮(黃酮苷);聚醯胺為氫鍵吸附,吸附能力與酚羥基多少、位置及氫鍵締合力大小有關,鑑別黃酮類化合物適用範圍廣。葛明菊[12] 利用聚醯胺薄層層析分析大血藤黃酮類化合物組成,藥用部位嫩莖含有Rf值為0.88的斑點而在其他部位無此斑點,分析該斑點可能為藥用成分。盧端萍等[13] 在矽膠G薄層板上以乙酸乙酯甲酸水(67∶13∶20)展開結果表明葫蘆茶中含蘆丁成分。黃酮苷類化合物極性強於游離黃酮,如與文獻[13]相比,王懷沖[14]在矽膠G薄層板上鑑別貫葉連翹中黃酮苷類(金絲桃苷)的存在,以極性大的展開劑醋酸乙酯丁酮甲醇水(5∶3∶1∶1)展開得到了很好的分離效果。對於既有較強極性的化合物,又有較弱極性成分的混合樣品中,可以採用二次或雙向展開。所以魚藤抽提液中的黃酮類化合物 [15]在矽膠H CMC薄板上用微量圓環技術快速而有效地找到了適合的展開劑,採用雙向展開得到了8個斑點,即以氯仿丙酮醋酸溶劑在豎直方向展開,再用甲苯氯仿丙酮溶劑在水平方向展開。含有多種極性成分的黃酮類化合物分離鑑別時可選用聚醯胺。劉嘉寶等 [16] 將聚醯胺薄層板以醋酸乙酯甲醇甲酸水(25∶1∶3∶23)為展開劑,紫外分析儀下檢視。供試液在以蘆丁、槲皮素、黃芩甙各標準液的相應位置出現相同的顏色斑點,它們的比移值Rf分別為0.46、0.20和0.16。因而可作定性分析的依據,說明雲南松花粉中主要含有黃酮類黃芩苷、黃酮醇類蘆丁及槲皮素3種成分。其他用於黃酮化合物薄層層析的吸附劑有纖維素、氰基矽膠等,纖維素用於分離極性強成分,氰基矽膠對於含不同極性成分或極性未知的黃酮化合物分離效果較佳[17]。
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