【關鍵詞】苦丁茶冬青葉多糖；,,提取；,,苯酚
摘要：目的 研究 苦丁茶冬青葉多糖含量的測定 方法 。方法以水提醇沉的方法從苦丁茶冬青葉中提取得到苦丁茶冬青葉多糖並以正交實驗優化顯色條件，採用苯酚-硫酸法測定其多糖含量。結果測定波長為482 nm，最佳顯色條件為6%苯酚用量1.0 ml，濃硫酸用量7.0 ml，反應時間40 min。標準曲線回歸方程為A＝0.054 6C-0.003 3（n＝10），r＝0.999 8，並在2.51～45.11 mg・L1範圍內呈良好線性關係。平均回收率為98.55％，RSD＝1.86％（n＝5）。測得多糖平均含量為31.90％，RSD＝1.75％（n＝6）。結論該方法簡單、準確、重現性好，可為其繼續研究開發及 應用 提供 參考 依據。
關鍵詞：苦丁茶冬青葉多糖； 提取； 苯酚硫酸法； 含量測定； 正交實驗
Extraction and Determination of the Polysaccharides from the Leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng
Abstract：ObjectiveTo study the determination method for polysaccharides in the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng.Methods The leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng were defatted with 95% EtOH，extracted with water and precipitated with 80% EtOH, and then was deprotEined three times by Sevag method, and from which , a crude polysaccharide noted as KPSⅡwas obtained. The traditional colorimetric method applied for the determination of polysaccharides from the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng was developed by the use of phenylhydrate-sulfuric acid, and was optimized by orthogonal experiment.Results The results showed that the wavelength for measurement was 482 nm. The best colorimetric conditions were the time of reaction of 40 min and the dosage of 6% phenylhydrate and H2SO4 of 1.0 and 7.0 ml, respectively. Linear range was 2.51～45.11 mg・L1(A＝0.054 6C-0.003 3，r＝0.999 8). The average recovery was 98.55% and RSD was 1.86% (n＝5). The polysaccharide content of KPSⅡ was 31.90％ and RSD was 1.75％ (n＝6). ConclusionThe method used in this paper is simple, accurate and stable. The result obtained may act as a base for the further study and application of it.
Key words：Polysaccharides from the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng; Extraction； Phenylhydrate-sulfuric acid method； Determination； Orthogonal experiment
苦丁茶冬青Ilex kudincha C. J. Tseng是冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬喬木植物，主產於湖南、湖北、廣東、廣西、海南等省。葉（苦丁茶）苦、甘、涼。清熱解毒，祛暑。主要用於 治療 頭痛、齒痛、目赤、熱病煩渴、痢疾等症［1］。近年來，已有人對苦丁茶冬青葉（苦丁茶）的化學成分和藥理作用作了一些研究，為其臨床應用提供了一定的 理論 依據［2］。迄今為止，對其具有生物活性的多糖成分研究未見報道。本文首次從苦丁茶冬青葉中分離提取得到粗多糖，並以正交設計L9（33）優化顯色條件，研究了苯酚-硫酸法測定苦丁茶冬青葉多糖含量的方法，為其進一步研究開發與應用提供了參考依據。
1 儀器與材料
1.1 原料苦丁茶冬青葉水提物精粉。苦丁茶冬青葉由海南澄邁萬昌苦丁茶場提供，經晾乾、粉碎後，用水於80℃浸提，提取液經濃縮後噴霧乾燥得紅棕色粉末，密封保存備用。
1.2 儀器紫外可見吸收光譜儀（UV2501PC，日本島津公司）；真空乾燥箱（8764S型，上海錦屏儀器儀表有限公司）；低速離心機（CL12，新專紅旗電機廠）；循環水式多用真空泵（SHBⅢ，鄭州長城科工貿有限公司）。
1.3 試劑苯酚（AR，鄭州市德眾化學試劑廠），使用前重蒸餾；無水乙醇、無水乙醚、95％乙醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸等均為國產 分析 純試劑，使用前未處理。
2 結果
2.1 多糖的提取［3,4］稱取苦丁茶冬青葉水提物噴霧乾燥粉末10 g，加入95％乙醇200 ml浸泡過夜，抽濾，取濾渣重複以上操作直至乙醇液無色時止。80 ℃烘乾，加入去離子水200 ml溶解，過濾除去不溶物質。向濾液中加入95％乙醇至含醇量達到80％，邊加邊攪拌，得灰白色絮狀沉澱。靜置6 h後進行離心分離沉澱，回收上層乙醇溶液，取固體部分再重複溶解、沉澱、離心分離操作至乙醇液澄清無色為止。溶解後，將體積比4 ∶1的三氯甲烷/正丁醇混合液等體積加入多糖溶液中，振蕩30 min後，靜置，除去中間層變性蛋白質，並收集上層清液，重複以上操作3次去除蛋白。加入4倍95%乙醇醇析，水溶後再醇析2次，固體部分用少量無水乙醇洗滌2次，再用無水乙醚洗滌2次， 自然 晾乾後放入真空乾燥箱乾燥4 h（50 ℃，0.096 MPa），得淺灰褐色固體，即為苦丁茶冬青葉粗多糖KPSⅡ。
2.2 含量測定
2.2.1 最大吸收波長的選擇精密吸取352.0 mg・L1苦丁茶冬青葉多糖KPSⅡ溶液1.0 ml置10 ml容量瓶中，加入6％苯酚1.0 ml，混勻，再加入7.0 ml硫酸，混勻後室溫放置30 min，以蒸餾水補至刻度，混勻。以蒸餾水替代多糖溶液如上法配製空白，在600～300 nm範圍內掃描，確定最大吸收波長。結果見圖1。確定最大吸收波長為482 nm。
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摘要：目的 研究 苦丁茶冬青葉多糖含量的測定 方法 。方法以水提醇沉的方法從苦丁茶冬青葉中提取得到苦丁茶冬青葉多糖並以正交實驗優化顯色條件，採用苯酚-硫酸法測定其多糖含量。結果測定波長為482 nm，最佳顯色條件為6%苯酚用量1.0 ml，濃硫酸用量7.0 ml，反應時間40 min。標準曲線回歸方程為A＝0.054 6C-0.003 3（n＝10），r＝0.999 8，並在2.51～45.11 mg・L1範圍內呈良好線性關係。平均回收率為98.55％，RSD＝1.86％（n＝5）。測得多糖平均含量為31.90％，RSD＝1.75％（n＝6）。結論該方法簡單、準確、重現性好，可為其繼續研究開發及 應用 提供 參考 依據。
關鍵詞：苦丁茶冬青葉多糖； 提取； 苯酚硫酸法； 含量測定； 正交實驗
Extraction and Determination of the Polysaccharides from the Leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng
Abstract：ObjectiveTo study the determination method for polysaccharides in the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng.Methods The leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng were defatted with 95% EtOH，extracted with water and precipitated with 80% EtOH, and then was deprotEined three times by Sevag method, and from which , a crude polysaccharide noted as KPSⅡwas obtained. The traditional colorimetric method applied for the determination of polysaccharides from the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng was developed by the use of phenylhydrate-sulfuric acid, and was optimized by orthogonal experiment.Results The results showed that the wavelength for measurement was 482 nm. The best colorimetric conditions were the time of reaction of 40 min and the dosage of 6% phenylhydrate and H2SO4 of 1.0 and 7.0 ml, respectively. Linear range was 2.51～45.11 mg・L1(A＝0.054 6C-0.003 3，r＝0.999 8). The average recovery was 98.55% and RSD was 1.86% (n＝5). The polysaccharide content of KPSⅡ was 31.90％ and RSD was 1.75％ (n＝6). ConclusionThe method used in this paper is simple, accurate and stable. The result obtained may act as a base for the further study and application of it.
Key words：Polysaccharides from the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng; Extraction； Phenylhydrate-sulfuric acid method； Determination； Orthogonal experiment
苦丁茶冬青Ilex kudincha C. J. Tseng是冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬喬木植物，主產於湖南、湖北、廣東、廣西、海南等省。葉（苦丁茶）苦、甘、涼。清熱解毒，祛暑。主要用於 治療 頭痛、齒痛、目赤、熱病煩渴、痢疾等症［1］。近年來，已有人對苦丁茶冬青葉（苦丁茶）的化學成分和藥理作用作了一些研究，為其臨床應用提供了一定的 理論 依據［2］。迄今為止，對其具有生物活性的多糖成分研究未見報道。本文首次從苦丁茶冬青葉中分離提取得到粗多糖，並以正交設計L9（33）優化顯色條件，研究了苯酚-硫酸法測定苦丁茶冬青葉多糖含量的方法，為其進一步研究開發與應用提供了參考依據。
1 儀器與材料
1.1 原料苦丁茶冬青葉水提物精粉。苦丁茶冬青葉由海南澄邁萬昌苦丁茶場提供，經晾乾、粉碎後，用水於80℃浸提，提取液經濃縮後噴霧乾燥得紅棕色粉末，密封保存備用。
1.2 儀器紫外可見吸收光譜儀（UV2501PC，日本島津公司）；真空乾燥箱（8764S型，上海錦屏儀器儀表有限公司）；低速離心機（CL12，新專紅旗電機廠）；循環水式多用真空泵（SHBⅢ，鄭州長城科工貿有限公司）。
1.3 試劑苯酚（AR，鄭州市德眾化學試劑廠），使用前重蒸餾；無水乙醇、無水乙醚、95％乙醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸等均為國產 分析 純試劑，使用前未處理。
2 結果
2.1 多糖的提取［3,4］稱取苦丁茶冬青葉水提物噴霧乾燥粉末10 g，加入95％乙醇200 ml浸泡過夜，抽濾，取濾渣重複以上操作直至乙醇液無色時止。80 ℃烘乾，加入去離子水200 ml溶解，過濾除去不溶物質。向濾液中加入95％乙醇至含醇量達到80％，邊加邊攪拌，得灰白色絮狀沉澱。靜置6 h後進行離心分離沉澱，回收上層乙醇溶液，取固體部分再重複溶解、沉澱、離心分離操作至乙醇液澄清無色為止。溶解後，將體積比4 ∶1的三氯甲烷/正丁醇混合液等體積加入多糖溶液中，振蕩30 min後，靜置，除去中間層變性蛋白質，並收集上層清液，重複以上操作3次去除蛋白。加入4倍95%乙醇醇析，水溶後再醇析2次，固體部分用少量無水乙醇洗滌2次，再用無水乙醚洗滌2次， 自然 晾乾後放入真空乾燥箱乾燥4 h（50 ℃，0.096 MPa），得淺灰褐色固體，即為苦丁茶冬青葉粗多糖KPSⅡ。
2.2 含量測定
2.2.1 最大吸收波長的選擇精密吸取352.0 mg・L1苦丁茶冬青葉多糖KPSⅡ溶液1.0 ml置10 ml容量瓶中，加入6％苯酚1.0 ml，混勻，再加入7.0 ml硫酸，混勻後室溫放置30 min，以蒸餾水補至刻度，混勻。以蒸餾水替代多糖溶液如上法配製空白，在600～300 nm範圍內掃描，確定最大吸收波長。結果見圖1。確定最大吸收波長為482 nm。
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