作者：塗玉亮,方馳華,鄒玉華
【關鍵詞】細胞間黏附分子
Expression and regulation of intercellular adhesion molecule1 in hepatic oval cells in rats
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) in hepatic oval cells (HOCs) and the regulation of nuclear factorκB (NFκB) in the expression of ICAM1. METHODS: Wistar rats were fed on feedstuff with 0.6 g/kg 3′methyldimethylaminoazo benzene(3′MeDAB) for 4 wk, HOCs were isolated by densitygradient centrifugation and immunocytochemistry was performed to detect the expression of ICAM1. HOCs were cultured in vitro respectively with TNFα, activator of NFκB, and TGFβ1, inhibitor of NFκB, and semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) assay was used to compare the amount of ICAM1 mRNA in HOCs cultured with TNFα and TGFβ1. RESULTS: Immunocytochemistry indicated that ICAM1 expression was positive. Compared with that in control group, the proliferation of HOCs was promoted in TNFα group (P<0.01) while it was influenced nonsignificantly in TGFβ1 group. Semiquantitative RTPCR assay indicated that the expressions of ICAM1 were upregulated in TNFα group (P<0.01) and downregulated in TGFβ1 group (P<0.01). CONCLUSION: ICAM1 is expressed in HOCs and the expression is regulated by NFκB activity change.
【Keywords】 intercellular adhesion molecule1； hepatic stem cells； NFkappa B
【摘要】 目的: 探討細胞間黏附分子1(ICAM1)在肝卵圓細胞(HOCs)中的表達,及核因子(NFκB)對其表達的調控作用. 方法 : 0.6 g/kg 3′甲基4二甲基胺偶氮苯（3′methyldimethylaminoazo benzene, DAB）飼喂Wistar大鼠4 wk,製作肝損傷模型.利用Percoll密度梯度離心法分離HOCs,免疫細胞化學檢測HOCs對ICAM1的表達；體外培養HOCs並分別用NFκB激動劑TNFα和NFκB抑制劑TGFβ1干預,RTPCR對ICAM1 mRNA進行半定量 分析 ,比較在TNFα和TGFβ1的調控下ICAM1 mRNA表達的變化. 結果: HOCs ICAM1免疫細胞化學檢測明顯陽性.與對照組比較,體外培養HOCs時TNFα促進HOCs的增殖(P<0.01),TGFβ1對HOCs的增殖能力無明顯 影響 ；RTPCR半定量分析, 與對照組比較，TNFα組ICAM1 mRNA相對灰度值增高(P<0.01),而TGFβ1組ICAM1 mRNA相對灰度值降低(P<0.01). 結論: 在肝損傷組織中HOCs表達ICAM1,TNFα和TGFβ1分別通過對NFκB活性的促進和抑制來調控ICAM1的表達.
【關鍵詞】 細胞間黏附分子1;肝卵圓細胞；核因子κB
0引言
近年來,肝卵圓細胞（hepatic stem cells,HOCs）的 研究 受到重視［1］.在大鼠肝損傷和肝癌模型的肝組織中存在HOCs大量增生［2］,但哪種細胞表達ICAM1還不完全清楚. 骨髓造血幹細胞（hemopoietic stem cells, HSCs）表面存在一組以ICAM1為主的黏附分子,能介導HSCs與骨髓基質的黏附,從而使HSCs產生一種定向遷移的作用［3］. 研究表明,HOCs可以來自於HSCs.既然HOCs可以來自於HSCs,且HSCs表達ICAM1,那麼HOCs也應象HSCs一樣能表達ICAM1. 為此,我們研究HOCs表達ICAM1的證據及其調控.
1材料和方法
1.1材料
Wistar大鼠6隻,雌雄不限,體質量(110±10) g,由南方醫科大學(原第一軍醫大學)實驗動物中心提供.3′甲基4二甲胺基偶氮苯（3′methyldimethylaminoazo benzene, DAB）購於日本東京化成株式會社；Percoll分離液購自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM1，即用型SABC試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程公司設計合成,βantin sense primer 5′ GCATTGTAACCAACTGGGACG 3′, antisense primer 5′ TTGCCGATAGTGATGACCT 3′,擴增產物長度為535 bp；ICAM1 sense primer, 5′ CGTGCTGTATGGTCCTCG 3′, antisense primer 5′ GGGCTTGTCCCTTGAGTT 3′,擴增產物長度422 bp；Marker購於上海生工生物工程公司；總RNA提取試劑盒、mRNA逆轉錄酶、Taq聚合酶購於Promega公司；Ⅳ型膠原酶、TNFα, TGFβ1購於Sigma公司.
1.2方法
Wistar大鼠正常飼喂1 wk後,給予含0.6 g/kg DAB飼料飼養,正常飲水,於4 wk後大鼠1隻,戊巴比妥鈉麻醉(25 mg/kg, ip),開腹,門靜脈切開插管,25 mL/min灌注DHanks液至肝表面淡黃除去肝組織里的血液,灌注0.6 g/L Ⅳ型膠原酶至肝組織黃色糜狀,將整塊肝組織移入燒杯搗碎,于震盪箱37℃恆溫震盪消化40 min,經100目篩網過濾,未過濾的組織塊繼續搗碎,加入0.6 g/L Ⅳ型膠原酶繼續震盪消化40 min,收集過濾液分裝於離心管中4℃ 100 g離心10 min,取上清液分裝於離心管4℃ 1000 g離心30 min,棄上清液,用DMEM基礎培養液稀釋細胞懸液.高速離心管分裝Percoll梯度離心液,細胞液鋪於上層,4℃ 12 000 g離心30 min,吸取700 mL/L和500 mL/L之間細胞液,DMEM基礎培養液稀釋,4℃ 1000 g離心30 min,棄上清液,用150 mL/L胎牛血清稀釋細胞密度至1.0×109/L. 取4個12孔培養板分別標記為A，B，C，D 4組,每組又分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ亞組,每亞組4孔,各孔加入上述細胞懸液0.5 mL,然後加適量細胞培養基, Ⅰ亞組為空白對照組, Ⅱ亞組和Ⅲ亞組分別加入2.0×105 U/L的TNFα和10 mg/L的TGFβ1.分別於3，6，9，12 d計數A，B，C，D組中各1組的細胞數.
【關鍵詞】細胞間黏附分子
Expression and regulation of intercellular adhesion molecule1 in hepatic oval cells in rats
【Abstract】 AIM: To investigate the expression of intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) in hepatic oval cells (HOCs) and the regulation of nuclear factorκB (NFκB) in the expression of ICAM1. METHODS: Wistar rats were fed on feedstuff with 0.6 g/kg 3′methyldimethylaminoazo benzene(3′MeDAB) for 4 wk, HOCs were isolated by densitygradient centrifugation and immunocytochemistry was performed to detect the expression of ICAM1. HOCs were cultured in vitro respectively with TNFα, activator of NFκB, and TGFβ1, inhibitor of NFκB, and semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) assay was used to compare the amount of ICAM1 mRNA in HOCs cultured with TNFα and TGFβ1. RESULTS: Immunocytochemistry indicated that ICAM1 expression was positive. Compared with that in control group, the proliferation of HOCs was promoted in TNFα group (P<0.01) while it was influenced nonsignificantly in TGFβ1 group. Semiquantitative RTPCR assay indicated that the expressions of ICAM1 were upregulated in TNFα group (P<0.01) and downregulated in TGFβ1 group (P<0.01). CONCLUSION: ICAM1 is expressed in HOCs and the expression is regulated by NFκB activity change.
【Keywords】 intercellular adhesion molecule1； hepatic stem cells； NFkappa B
【摘要】 目的: 探討細胞間黏附分子1(ICAM1)在肝卵圓細胞(HOCs)中的表達,及核因子(NFκB)對其表達的調控作用. 方法 : 0.6 g/kg 3′甲基4二甲基胺偶氮苯（3′methyldimethylaminoazo benzene, DAB）飼喂Wistar大鼠4 wk,製作肝損傷模型.利用Percoll密度梯度離心法分離HOCs,免疫細胞化學檢測HOCs對ICAM1的表達；體外培養HOCs並分別用NFκB激動劑TNFα和NFκB抑制劑TGFβ1干預,RTPCR對ICAM1 mRNA進行半定量 分析 ,比較在TNFα和TGFβ1的調控下ICAM1 mRNA表達的變化. 結果: HOCs ICAM1免疫細胞化學檢測明顯陽性.與對照組比較,體外培養HOCs時TNFα促進HOCs的增殖(P<0.01),TGFβ1對HOCs的增殖能力無明顯 影響 ；RTPCR半定量分析, 與對照組比較，TNFα組ICAM1 mRNA相對灰度值增高(P<0.01),而TGFβ1組ICAM1 mRNA相對灰度值降低(P<0.01). 結論: 在肝損傷組織中HOCs表達ICAM1,TNFα和TGFβ1分別通過對NFκB活性的促進和抑制來調控ICAM1的表達.
【關鍵詞】 細胞間黏附分子1;肝卵圓細胞；核因子κB
0引言
近年來,肝卵圓細胞（hepatic stem cells,HOCs）的 研究 受到重視［1］.在大鼠肝損傷和肝癌模型的肝組織中存在HOCs大量增生［2］,但哪種細胞表達ICAM1還不完全清楚. 骨髓造血幹細胞（hemopoietic stem cells, HSCs）表面存在一組以ICAM1為主的黏附分子,能介導HSCs與骨髓基質的黏附,從而使HSCs產生一種定向遷移的作用［3］. 研究表明,HOCs可以來自於HSCs.既然HOCs可以來自於HSCs,且HSCs表達ICAM1,那麼HOCs也應象HSCs一樣能表達ICAM1. 為此,我們研究HOCs表達ICAM1的證據及其調控.
1材料和方法
1.1材料
Wistar大鼠6隻,雌雄不限,體質量(110±10) g,由南方醫科大學(原第一軍醫大學)實驗動物中心提供.3′甲基4二甲胺基偶氮苯（3′methyldimethylaminoazo benzene, DAB）購於日本東京化成株式會社；Percoll分離液購自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM1，即用型SABC試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程公司設計合成,βantin sense primer 5′ GCATTGTAACCAACTGGGACG 3′, antisense primer 5′ TTGCCGATAGTGATGACCT 3′,擴增產物長度為535 bp；ICAM1 sense primer, 5′ CGTGCTGTATGGTCCTCG 3′, antisense primer 5′ GGGCTTGTCCCTTGAGTT 3′,擴增產物長度422 bp；Marker購於上海生工生物工程公司；總RNA提取試劑盒、mRNA逆轉錄酶、Taq聚合酶購於Promega公司；Ⅳ型膠原酶、TNFα, TGFβ1購於Sigma公司.
1.2方法
Wistar大鼠正常飼喂1 wk後,給予含0.6 g/kg DAB飼料飼養,正常飲水,於4 wk後大鼠1隻,戊巴比妥鈉麻醉(25 mg/kg, ip),開腹,門靜脈切開插管,25 mL/min灌注DHanks液至肝表面淡黃除去肝組織里的血液,灌注0.6 g/L Ⅳ型膠原酶至肝組織黃色糜狀,將整塊肝組織移入燒杯搗碎,于震盪箱37℃恆溫震盪消化40 min,經100目篩網過濾,未過濾的組織塊繼續搗碎,加入0.6 g/L Ⅳ型膠原酶繼續震盪消化40 min,收集過濾液分裝於離心管中4℃ 100 g離心10 min,取上清液分裝於離心管4℃ 1000 g離心30 min,棄上清液,用DMEM基礎培養液稀釋細胞懸液.高速離心管分裝Percoll梯度離心液,細胞液鋪於上層,4℃ 12 000 g離心30 min,吸取700 mL/L和500 mL/L之間細胞液,DMEM基礎培養液稀釋,4℃ 1000 g離心30 min,棄上清液,用150 mL/L胎牛血清稀釋細胞密度至1.0×109/L. 取4個12孔培養板分別標記為A，B，C，D 4組,每組又分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ亞組,每亞組4孔,各孔加入上述細胞懸液0.5 mL,然後加適量細胞培養基, Ⅰ亞組為空白對照組, Ⅱ亞組和Ⅲ亞組分別加入2.0×105 U/L的TNFα和10 mg/L的TGFβ1.分別於3，6，9，12 d計數A，B，C，D組中各1組的細胞數.
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