人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗的研究進展 - 網紅主持

[關鍵詞]宮頸癌
健康網訊:

　李娟　王佑春　宮頸癌是嚴重危害婦女健康和生命的疾病，每年約有50萬新發病例，25萬人死亡，是引起婦女死亡的第二大原因，其中大部分在發展中國家，占80%左右［1］。1977年德國學者ZurHausen等從宮頸癌標本中發現了人乳頭瘤病毒（humanp apillomavirus，HPV）DNA，推測HPV感染與宮頸癌發生有關。進一步的分子流行病學證據表明，HPV與人類多種癌症，特別是與宮頸癌有著密切的關係。由國際癌症研究機構（IARC）組織在22個國家進行了針對引起侵襲性宮頸癌（ICC）的HPV類型的調查［2］。組織學確診為ICC的1000個病例中有99.7%發現HPVDNA陽性，其上HPV的類型主要為HPV16（53%）和HPV18（15%）。
1機體對HPV感染的免疫反應 HPV屬乳頭多瘤空泡病毒科（Papovaviridae）乳頭瘤病毒屬，是一類感染表皮和粘膜鱗狀上皮的小DNA病毒。其基因組為雙鏈環狀DNA，長7.5～8.0kb，含8個開放閱讀框（openreadingframes，ORFs），依功能不同分3個區:（1）早期區（e arlyregion，E區）:分別編碼E1、E2、E4、E5、E6、E7等六個早期蛋白，參與病毒DNA的複製、轉錄、翻譯調控和轉化等功能。（2）晚期區（lateregion，L區） :編碼主要外殼蛋白L1和次要外殼蛋白L2。（3）非編碼區（uncodingregion，UC R）或上游調控區（URR）:含有HPV基因組DNA的複製起點和HPV表達所必需的調控元件。按照HPV感染與宮頸癌發生的危險性，將HPV分為低危型（HPV1，6，11等）和高危型（HPV16，18，31，45等）。低危型HPV主要引起表皮細胞良性增生，如HPV 6和11型可引起生殖器疣和兒童復發性乳頭瘤。高危型HPV與宮頸上皮內瘤的發生和惡變以及其他上皮性腫瘤的發生相關。HPV感染在人群中較為普通，大部分人在性生活開始後，都感染過該病毒。病毒通過受損的上皮組織進入基底層細胞，其複製周期受嚴格的調節，並依賴於病毒編碼的蛋白質和宿主上皮細胞的分化程度。病毒感染通常為局部限制性，不引起炎症反應。大多數人都能自行清除病毒，只有一小部分人由於免疫系統的原因無法清除病毒，造成HPV持續存在，繼而發展為宮頸癌。許多證據表明HPV感染能激發宿主免疫反應，如大多數皮膚疣兩年內可自發消退，且多處感染灶同時消退［3］。大多數人在性生活開始後，都感染過HPV，隨後感染率降低，說明免疫系統可以清除病毒並長期產生保護作用。HPV中和抗體可以保護機體免受病毒的感染，但對已經存在的病毒，則需要細胞免疫來清除已感染的細胞。在宮頸損傷病人的消退過程中大多可檢測到細胞免疫反應的升高［4］ ;而免疫抑制如器官移植時，病人患疣的機率增大;HIV病人比健康人患尖銳濕疣的機率高2～7倍;由此可見，細胞介導的免疫機制對於控制HPV感染有重要的作用。 2HPV疫苗研究現狀
由於從感染灶組織中很難分離到病毒體，迄今未能建立體外培養系統進行病毒培養。目前對宮頸癌的治療基本以手術和放療為主，給病人帶來很大的痛苦。預防 HPV相關癌症的最有效的方法是研製特異性的疫苗，誘導機體產生中和抗體，激發保護性免疫反應，達到有效預防與癌症相關型的HPV傳播的目的，降低宮頸癌的發生率，並且可能降低與HPV感染弱相關的癌症如肛門、外陰或扁桃體癌的發生率。由於E6、E7蛋白具有轉化活性，使用全病毒做疫苗有致癌的危險，因此，目前的研制方向主要集中在亞單位疫苗方面。根據其功能不同，疫苗分為預防性疫苗和治療性疫苗。預防性疫苗多以HPV的主要衣殼蛋白L1體外表達形成的病毒樣顆粒（VLPs ）為靶抗原，誘導機體產生特異性的中和抗體。治療性疫苗則以HPV早期蛋白如改造過的E6、E7蛋白作為靶抗原，誘導產生特異性的細胞免疫反應，用於CIN和宮頸癌的免疫治療。近年來研究的如嵌合型病毒樣顆粒疫苗、HPV假病毒疫苗等同時具有預防和治療雙重功能。 2.1病毒樣顆粒（VLPs）HPV有兩種衣殼蛋白，主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2。在天然HPV病毒顆粒形成過程中，衣殼蛋白包裝病毒DNA形成成熟的病毒顆粒。研究表明，在許多表達體系如哺乳動物細胞、酵母和細菌［5，6］中，單獨 L1或L1和L2共表達後可自行組裝成不含病毒DNA的病毒樣顆粒（VLPs），這種VLPs 結構與天然的病毒顆粒相似，用來免疫動物誘導產生高滴度的中和抗體，證明在V LP表面存在中和抗體的表位［7］。由於L1抗體識別構象依賴的型特異表位，因此，保持一定的空間構象對VLP的免疫原性非常重要。當其變性後便失去誘導產生中和抗體的能力。HPVVLPs還能通過MHCI途徑誘導產生細胞免疫。HPV16型L1裝配成的VLPs經鼻免疫小鼠後，可在脾及陰道淋巴組織中發生淋巴細胞增殖。以產生I FN-γ的CD4+T細胞增為主，髂骨淋巴細胞中增生的T淋巴細胞具有CTL活性，說明 VLPs可誘導MHCI類限制性CD8+反應［8］。動物實驗證明VLP誘導產生的抗體對動物的保護率幾乎達到100%，說明體液免疫足夠保護機體免受病毒的感染。對VLP疫苗進行的一些臨床試驗也證明了其安全有效性。在健康人群中進行的隨機、雙盲實驗對HPV16L1VLP的安全性和免疫原性進行了評價。結果表明所有的疫苗均有極好的耐受性，受試者均發生血清陽轉，在沒有佐劑的情況下也有很好的免疫原性［9］。HPV11L1VLP在健康志願者中進行的 Ⅰ期臨床試驗得到相似的結果。由Merck，GlaxoSmithKline和NIH生產的VLPs疫苗和不同的早期蛋白與L1/L2蛋白組成嵌和病毒樣顆粒cVLP正在進行Ⅲ期臨床試驗［ 10］。Ⅰ和Ⅱ期臨床實驗證明HPVVLPs疫苗是安全的，並有高度的免疫原性，V LPs免疫後誘導產生的中和抗體效價是自然感染的100倍。1998年10月～1999年11月，在美國女性中進行了HPV16L1VLP臨床試驗。酵母表達的VLP純化後吸附於鋁佐劑，免疫組抗體效價遠遠高於對照組。免疫後17.4個月跟蹤調查顯示，對照組HPV16 持續感染率為3.8%，免疫組為0。所有9例HPV16相關的宮頸上皮內瘤均發生在對照組［11］。該實驗結果充分說明了VLP是最有前途的疫苗之一。高危型HPV的早期蛋白E6、E7持續表達於HPV感染的腫瘤細胞上，因此，可作為誘導腫瘤特異性CTL反應的最佳靶抗原。Muller等［12］用HPV16E7蛋白部分序列代替L1蛋白C端34的胺基酸，構建了cVLP。實驗證明C端插入60個胺基酸不影響 V LP的形成，免疫動物後誘導產生中和抗體。因此，利用這一特點，C端還可以插入其它HPV特異序列或非HPV特異序列，如已知的腫瘤抗原的T細胞表位。各種研究證明不同HPV誘導的中和抗體的保護作用具有型特異性。使用ELISA和交叉中和實驗對九種HPV（6，11，16，18，31，33，35，39，45）亞型進行了免疫活性分析，HPV 衣殼蛋白具有高度的免疫原性和型特異性，但不同類型之間的交叉中和活性很低［13］。體外感染實驗表明只有同型的VLP抗血清才能中和假病毒顆粒。因此，許多疫苗採用多型混合免疫的策略，如包括16，18，31和45的VLPs能夠預防75%的宮頸癌［1］。在預防性疫苗VLPs中至少還應該包括一種非癌基因型HPV，如HP V6主要引起生殖疣，針對它的抗體與HPV11有交叉中和活性，而HPV11是引起生殖疣的第二大原因。包括低危型HPV的多價疫苗有可能解決生殖疣高頻率發生的問題和治療上的困難。 2.2DNA疫苗DNA疫苗是將編碼外源蛋白基因的質粒DNA直接導入體內，外源基因表達後呈遞給免疫系統，分別誘導產生細胞免疫和體液免疫應答。在過去的十多年裡，DNA疫苗研究已經從實驗室發展到初步的臨床試驗階段，成為防治傳染病、腫瘤的研究熱點。目前研究的HPVDNA疫苗既有包含早期基因的治療性疫苗，也有包含晚期基因的預防性疫苗。HPV16L1DNA疫苗能有效刺激陰道CD8+T細胞，這對消除病毒感染的細胞十分重要。當生殖道粘膜基底層鱗狀上皮細胞暴露於病毒時，就會感染HPV 。有效預防HPV感染的疫苗應該在病毒入侵的局部提供免疫保護作用。分泌型IgA能夠與病毒結合，阻止其附著上皮細胞，因此，具有病毒中和活性的SIgA在預防局部感染和疾病的發生中起著重要的作用，是預防病毒侵入的第一道防線。在人和猴子的生殖道粘膜組織中檢測細胞免疫和抗體分泌細胞證實，恰當的免疫途徑能夠在生殖道誘發產生抗體和CTL反應。HPV16L1DNA疫苗鼻腔免疫BALB/c後，產後細胞免疫和陰道粘膜局部免疫，但只能誘發弱的體液免疫反應。因此，鼻內免疫不能作為一個有效的途徑，可以與HPV16L1VLP結合使用，增強VLP的免疫能力［14］。其他的一些實驗證實粘膜免疫不僅發生在疫苗注射部位，還可發生在遠端粘膜部位［ 15］。 HPV16E7DNA疫苗免疫小鼠，誘導產生較強的E7特異性CTL反應，保護小鼠免受腫瘤細胞的攻擊。使用突變的E7DNA疫苗免疫產生的保護作用優於野生型DNA疫苗免疫效果。由於E7蛋白的轉化活性，採用不同方法將其突變來消除轉化活性，增加疫苗的安全性［16］。使用改造過的DNA免疫C57BL/6小鼠，不僅誘導產生E7特異性CTL，還能保護小鼠免受E7陽性腫瘤細胞的攻擊。 DNA疫苗的安全性，特別是免疫後質粒的組織分布和整合是限制其應用的主要問題。不同實驗室對此類問題進行了多方面的研究［17，18］，沒有發現外源 DNA與基因組整合的證據，同時還證明DNA疫苗接種後不會誘導產生自身DNA抗體，引起免疫系統功能紊亂。