作者：徐振曄，劉建文，周美雲
【關鍵詞】懸飲寧方
［摘要］ 目的：觀察中藥懸飲寧方抑制人肺腺癌細胞SPCA1浸潤的作用及對S180腹水瘤小鼠腹膜病理形態學變化的 影響 。 方法 ：在進行小鼠腹膜間皮細胞分離培養的基礎上，將SPCA1人肺腺癌細胞調整加入復層培養，觀察形成的克隆數。取出S180腹水瘤小鼠腹膜，用透射電鏡觀察懸飲寧方各劑量組小鼠腹膜病理形態學的變化。結果：體外實驗顯示加入含有懸飲寧生藥的培養液(50 μg/ml)後，SPCA1在瓊脂培養皿背面形成的癌細胞克隆數明顯減少。用懸飲寧 治療 S180腹水瘤小鼠後，取出腹膜，在電鏡下可觀察到，從低劑量開始即可見小鼠腹膜間皮細胞排列整齊，隨著劑量的遞增這種現象更明顯，間皮細胞排列更加整齊，增厚；而生理鹽水組小鼠腹膜間皮細胞排列疏鬆，壞死。結論：中藥懸飲寧方有抑制SPCA1細胞浸潤的作用，懸飲寧還可以改變S180腹水瘤小鼠排列疏鬆的腹膜間皮細胞，從而控制腹水瘤小鼠癌性積液生長。
［關鍵詞］ 懸飲寧方; SPCA1細胞; 間皮細胞; S180腹水瘤; 小鼠
Effects of Xuanyinning Recipe on invasion of SPCA1 cells and pathomorphological changes of peritoneum in mice inoculated with sarcoma 180
ABSTRACT Objective: To observe the effects of Xuanyinning Recipe (XYNR) in inhibiting SPCA1 cellular infiltration and on the pathomorphological changes of peritoneum in mice inoculated with sarcoma 180 (S180). Methods: On the bases of isolated culture of mouse peritoneal mesothelial cells, we adjusted and added the human lung adenocarcinoma cell line SPCA1 into the doublelayer culture medium to observe the number of clones formed. We also took out the peritoneum from the mice administered with three different dosages of XYNR and observed its pathomorphological changes with transmission electron microscope. Results: In the in vitro experiment, the number of clones of SPCA1 in culture medium with XYNR (50 μg/ml) decreased distinctly. In the in vivo experiment, it was observed that, in the peritoneum from the XYNRtreated mice inoculated with S180, the mesothelial cells arranged more and more regularly with the increasing of the dosage of XYNR, while the mesothelial cells in the peritoneum of the mice in the control group necrosed and arranged loosely. Conclusion: XYNR can inhibit the invasion of SPCA1 cells. It also can improve the loose arrangement of the peritoneal mesothelial cells in mice inoculated with S180, so as to inhibit the malignant effusion.
KEY WORDS Xuanyinning Recipe; SPCA1 cells; mesothelial cells; sarcoma 180; mice
研究 資料表明，大約50%的癌症轉移患者最終發生癌性積液［1］。而癌性積液的出現常常預示著疾病的進展和生活質量的下降，表明疾病進入晚期，生存時間4～6個月［2］。我們在臨床及實驗中觀察到中藥懸飲寧方能有效地控制癌性積液生長［3］，為了進一步探討懸飲寧方抑制癌性積液生長的作用機制，我們進行了懸飲寧方對SPCA1細胞浸潤作用的體外實驗，並通過電鏡觀察該方對S180腹水瘤小鼠腹膜組織病理形態的影響，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑 超凈工作檯，上海大華醫療儀器廠生產；CO2培養箱，日本平尺株式會社生產；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司製造；達氏修正依氏培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）培養粉，由日本製藥株式會社生產；表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)，由上海細胞生物學研究所提供；胰酶、酚紅、瓊脂粉、35 mm培養皿均由 中國 科學 院實生細胞生物技術公司提供；順氯氨鉑，由中國齊魯製藥廠生產(批號：9386162)，規格20 mg／瓶；S180腹水瘤細胞株，引自中國科學院上海分院藥物研究所。
1.2 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g，6～8周齡，由中國科學院上海分院實驗動物中心提供（動物合格證號：中科動管005）。
1.3 實驗藥物製備
1.3.1 體外實驗用藥 懸飲寧液藥物按協定比例配方（由生白朮、川椒目、葶藶子、貓人參等中藥組成），用三蒸水煎取，用乙醇明膠沉澱法製成，生藥終濃度為1 g／m1，pH值為6.8～7.2。
1.3.2 體內實驗用藥 懸飲寧藥液由上海中醫藥大學龍華 醫院 中藥藥房提供，每毫升含生藥濃度為2.8 g。用生理鹽水稀釋成2.49、1.2、0.6 g／ml。按《中藥藥理實驗方法學》附表「人和動物間接體表面積折算表［4］」， 計算 出高、中、低不同劑量組的用藥劑量分別為52.36、32.36、20 g／kg；每隻小鼠每日用藥量分別為1.047、0.647、0.4 g，灌胃用藥。順氯氨鉑，用生理鹽水稀釋成0.2 mg／m1，1 mg／kg，每日腹腔注射1次。
1.4 實驗方法
1.4.1 抑制SPCA1細胞浸潤作用的體外研究
1.4.1.1 腹膜間皮細胞的分離培養 把正常小鼠脫頸處死後，剖腹在無菌條件下由小腸間膜內的脂肪組織取出回盲腸部向口側方向的三角形半透明膜，儘量剔除脂肪，置入PBS沖洗後，加入0.25％胰蛋白酶，置37 ℃消化10～20 min，吸出消化液，離心收集細胞，用 DMEM培養液（配製方法：DMEM培養粉,加入L右氨醯氨0.3 g/L、小牛血清、青黴素200 U/ml、鏈黴素200 U/m1、EGF 25 ng／m1，pH 6.8~7.2），在培養瓶中置37 ℃、5％CO2培養箱中培養。
1.4.1.2 間皮細胞層上的癌細胞復層培養 上述鼠腹膜間皮細胞經傳至3～5代後，即可轉入鋪有瓊脂的35 mm的培養皿培養，每隻培養皿細胞數為105，隔2 d更換新鮮培養液，經5～7 d培養後，間皮細胞貼壁生長成片狀。待間皮細胞生長成片狀後，將SPCA1人肺腺癌細胞株(每隻培養皿細胞數為2×105)調整加入每隻培養皿後，在倒置顯微鏡下取一視野進行觀察，約經5 h左右，可觀察到癌細胞伸出偽足，開始侵入，7 h後癌細胞穿越間皮細胞間隙，次日(24 h後)可在培養皿的背面，間皮細胞下層分裂，逐浙形成克隆。
1.4.1.3 懸飲寧方對癌細胞浸潤腹膜間皮細胞的影響 將懸飲寧液用DMEM培養液稀釋成6.25、25、50 μg/m1三種不同濃度，pH (7.0±2)。分為空白對照組、中藥Ⅰ組(6.25 μg/m1)、中藥Ⅱ組(25 μg/m1)、中藥Ⅲ組(50 μg/m1)，共4組，每組n=3。在培養皿中置入SPCA1人肺腺癌細胞後，移入含不同濃度生藥的培養液，經培養72 h後觀察培養皿背面形成的克隆數，換算成克隆數／cm2，作統計學處理，比較組間差異。
1.4.2 S180腹水瘤小鼠病理形態學觀察
1.4.2.1 瘤株及移植方法 S180腹水瘤細胞株於昆明種小鼠腹腔移植傳代。取移植14 d左右的小鼠，無菌操作，從腹腔抽出腹水瘤細胞液，經生理鹽水稀釋，調整細胞濃度為2×l06，於每隻正常小鼠腹腔注射0.5 m1，約含S180細胞1×106，接種完畢後於次日開始用藥。
1.4.2.2 實驗動物分組 經造模後隨機分為5組，每組12隻。生理鹽水組：每日以生理鹽水1 m1灌胃；順氯氨鉑化療組每日腹腔注射順氯氨鉑0.02 mg (1 mg/kg)，共5 d；懸飲寧治療Ⅰ組每日0.4 g(20 g/kg)生藥灌胃，懸飲寧治療Ⅱ組每日0.647 g(32.36 g／kg)生藥灌胃，懸飲寧治療Ⅲ組每日1.047 g(52.36 g／kg)生藥灌胃。第―批每組用藥共18 d，第二批觀察14 d，每組各8隻實驗小鼠。
1.4.2.3 腹膜組織的病理形態學觀察 脫頸處死小鼠，取出腹膜，用2.5％戊二醛固定，然後用2％鋨酸再固定，梯度酒精脫水，EPON812環氧樹脂包埋，超薄切片，經醋酸鈉及檸檬酸鉛染色，JEMl00B透射電鏡觀察。
1.5 統計學方法 計量資料用t檢驗。
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【關鍵詞】懸飲寧方
［摘要］ 目的：觀察中藥懸飲寧方抑制人肺腺癌細胞SPCA1浸潤的作用及對S180腹水瘤小鼠腹膜病理形態學變化的 影響 。 方法 ：在進行小鼠腹膜間皮細胞分離培養的基礎上，將SPCA1人肺腺癌細胞調整加入復層培養，觀察形成的克隆數。取出S180腹水瘤小鼠腹膜，用透射電鏡觀察懸飲寧方各劑量組小鼠腹膜病理形態學的變化。結果：體外實驗顯示加入含有懸飲寧生藥的培養液(50 μg/ml)後，SPCA1在瓊脂培養皿背面形成的癌細胞克隆數明顯減少。用懸飲寧 治療 S180腹水瘤小鼠後，取出腹膜，在電鏡下可觀察到，從低劑量開始即可見小鼠腹膜間皮細胞排列整齊，隨著劑量的遞增這種現象更明顯，間皮細胞排列更加整齊，增厚；而生理鹽水組小鼠腹膜間皮細胞排列疏鬆，壞死。結論：中藥懸飲寧方有抑制SPCA1細胞浸潤的作用，懸飲寧還可以改變S180腹水瘤小鼠排列疏鬆的腹膜間皮細胞，從而控制腹水瘤小鼠癌性積液生長。
［關鍵詞］ 懸飲寧方; SPCA1細胞; 間皮細胞; S180腹水瘤; 小鼠
Effects of Xuanyinning Recipe on invasion of SPCA1 cells and pathomorphological changes of peritoneum in mice inoculated with sarcoma 180
ABSTRACT Objective: To observe the effects of Xuanyinning Recipe (XYNR) in inhibiting SPCA1 cellular infiltration and on the pathomorphological changes of peritoneum in mice inoculated with sarcoma 180 (S180). Methods: On the bases of isolated culture of mouse peritoneal mesothelial cells, we adjusted and added the human lung adenocarcinoma cell line SPCA1 into the doublelayer culture medium to observe the number of clones formed. We also took out the peritoneum from the mice administered with three different dosages of XYNR and observed its pathomorphological changes with transmission electron microscope. Results: In the in vitro experiment, the number of clones of SPCA1 in culture medium with XYNR (50 μg/ml) decreased distinctly. In the in vivo experiment, it was observed that, in the peritoneum from the XYNRtreated mice inoculated with S180, the mesothelial cells arranged more and more regularly with the increasing of the dosage of XYNR, while the mesothelial cells in the peritoneum of the mice in the control group necrosed and arranged loosely. Conclusion: XYNR can inhibit the invasion of SPCA1 cells. It also can improve the loose arrangement of the peritoneal mesothelial cells in mice inoculated with S180, so as to inhibit the malignant effusion.
KEY WORDS Xuanyinning Recipe; SPCA1 cells; mesothelial cells; sarcoma 180; mice
研究 資料表明，大約50%的癌症轉移患者最終發生癌性積液［1］。而癌性積液的出現常常預示著疾病的進展和生活質量的下降，表明疾病進入晚期，生存時間4～6個月［2］。我們在臨床及實驗中觀察到中藥懸飲寧方能有效地控制癌性積液生長［3］，為了進一步探討懸飲寧方抑制癌性積液生長的作用機制，我們進行了懸飲寧方對SPCA1細胞浸潤作用的體外實驗，並通過電鏡觀察該方對S180腹水瘤小鼠腹膜組織病理形態的影響，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑 超凈工作檯，上海大華醫療儀器廠生產；CO2培養箱，日本平尺株式會社生產；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司製造；達氏修正依氏培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）培養粉，由日本製藥株式會社生產；表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)，由上海細胞生物學研究所提供；胰酶、酚紅、瓊脂粉、35 mm培養皿均由 中國 科學 院實生細胞生物技術公司提供；順氯氨鉑，由中國齊魯製藥廠生產(批號：9386162)，規格20 mg／瓶；S180腹水瘤細胞株，引自中國科學院上海分院藥物研究所。
1.2 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g，6～8周齡，由中國科學院上海分院實驗動物中心提供（動物合格證號：中科動管005）。
1.3 實驗藥物製備
1.3.1 體外實驗用藥 懸飲寧液藥物按協定比例配方（由生白朮、川椒目、葶藶子、貓人參等中藥組成），用三蒸水煎取，用乙醇明膠沉澱法製成，生藥終濃度為1 g／m1，pH值為6.8～7.2。
1.3.2 體內實驗用藥 懸飲寧藥液由上海中醫藥大學龍華 醫院 中藥藥房提供，每毫升含生藥濃度為2.8 g。用生理鹽水稀釋成2.49、1.2、0.6 g／ml。按《中藥藥理實驗方法學》附表「人和動物間接體表面積折算表［4］」， 計算 出高、中、低不同劑量組的用藥劑量分別為52.36、32.36、20 g／kg；每隻小鼠每日用藥量分別為1.047、0.647、0.4 g，灌胃用藥。順氯氨鉑，用生理鹽水稀釋成0.2 mg／m1，1 mg／kg，每日腹腔注射1次。
1.4 實驗方法
1.4.1 抑制SPCA1細胞浸潤作用的體外研究
1.4.1.1 腹膜間皮細胞的分離培養 把正常小鼠脫頸處死後，剖腹在無菌條件下由小腸間膜內的脂肪組織取出回盲腸部向口側方向的三角形半透明膜，儘量剔除脂肪，置入PBS沖洗後，加入0.25％胰蛋白酶，置37 ℃消化10～20 min，吸出消化液，離心收集細胞，用 DMEM培養液（配製方法：DMEM培養粉,加入L右氨醯氨0.3 g/L、小牛血清、青黴素200 U/ml、鏈黴素200 U/m1、EGF 25 ng／m1，pH 6.8~7.2），在培養瓶中置37 ℃、5％CO2培養箱中培養。
1.4.1.2 間皮細胞層上的癌細胞復層培養 上述鼠腹膜間皮細胞經傳至3～5代後，即可轉入鋪有瓊脂的35 mm的培養皿培養，每隻培養皿細胞數為105，隔2 d更換新鮮培養液，經5～7 d培養後，間皮細胞貼壁生長成片狀。待間皮細胞生長成片狀後，將SPCA1人肺腺癌細胞株(每隻培養皿細胞數為2×105)調整加入每隻培養皿後，在倒置顯微鏡下取一視野進行觀察，約經5 h左右，可觀察到癌細胞伸出偽足，開始侵入，7 h後癌細胞穿越間皮細胞間隙，次日(24 h後)可在培養皿的背面，間皮細胞下層分裂，逐浙形成克隆。
1.4.1.3 懸飲寧方對癌細胞浸潤腹膜間皮細胞的影響 將懸飲寧液用DMEM培養液稀釋成6.25、25、50 μg/m1三種不同濃度，pH (7.0±2)。分為空白對照組、中藥Ⅰ組(6.25 μg/m1)、中藥Ⅱ組(25 μg/m1)、中藥Ⅲ組(50 μg/m1)，共4組，每組n=3。在培養皿中置入SPCA1人肺腺癌細胞後，移入含不同濃度生藥的培養液，經培養72 h後觀察培養皿背面形成的克隆數，換算成克隆數／cm2，作統計學處理，比較組間差異。
1.4.2 S180腹水瘤小鼠病理形態學觀察
1.4.2.1 瘤株及移植方法 S180腹水瘤細胞株於昆明種小鼠腹腔移植傳代。取移植14 d左右的小鼠，無菌操作，從腹腔抽出腹水瘤細胞液，經生理鹽水稀釋，調整細胞濃度為2×l06，於每隻正常小鼠腹腔注射0.5 m1，約含S180細胞1×106，接種完畢後於次日開始用藥。
1.4.2.2 實驗動物分組 經造模後隨機分為5組，每組12隻。生理鹽水組：每日以生理鹽水1 m1灌胃；順氯氨鉑化療組每日腹腔注射順氯氨鉑0.02 mg (1 mg/kg)，共5 d；懸飲寧治療Ⅰ組每日0.4 g(20 g/kg)生藥灌胃，懸飲寧治療Ⅱ組每日0.647 g(32.36 g／kg)生藥灌胃，懸飲寧治療Ⅲ組每日1.047 g(52.36 g／kg)生藥灌胃。第―批每組用藥共18 d，第二批觀察14 d，每組各8隻實驗小鼠。
1.4.2.3 腹膜組織的病理形態學觀察 脫頸處死小鼠，取出腹膜，用2.5％戊二醛固定，然後用2％鋨酸再固定，梯度酒精脫水，EPON812環氧樹脂包埋，超薄切片，經醋酸鈉及檸檬酸鉛染色，JEMl00B透射電鏡觀察。
1.5 統計學方法 計量資料用t檢驗。
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